论文摘要
研究背景:随着医学的发展和进步,关节软骨损伤的早期诊断和治疗受到重视,关节软骨组织内无神经、血管、淋巴的特殊性,决定了其难以自行修复。全层骨软骨一旦损伤只能够由纤维软骨修复,但是这种修复组织缺乏正常软骨组织所具有的生物学、生物化学、和生物力学特性,因此在关节活动过程中压力的刺激下很容易发生退变。因此,各种各样的手术（关节成形术、钻孔术、微骨折术等）,被应用于临床,试图刺激骨髓干细胞,产生具有接近透明软骨特性的软骨来修复软骨缺损,事实证明了,这些修复组织因压力的刺激很快发生退变。目前组织工程的出现作为一门新兴学科,已迅速成为生物医学领域的一门国际性的前沿学科,受到科研人员的高度重视。它综合利用了工程学原理及方法和生命科学技术,以适当的生物可降解材料为载体支撑,整合入种子细胞,在模拟接近体内生物环境的条件下进行培养,形成“细胞—材料”复合物,利用此复合物重建和修复病损的组织,随着支架材料的不断降解和种子细胞的不断增殖,复合物逐渐形成了具有与正常组织相同的生物活性和功能的新生组织,并将缺损修复。此方法突破了传统的治疗模式,为组织再生甚至器官重建开辟了新的思路和方法。目的:本研究以中国山羊为动物模型,研究羊骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外分离纯化、培养扩增的方法;评价BMSC复合关节软骨细胞外基质（ACECM）源性取向支架的效果;并探讨利用自体骨髓基质干细胞（BMSCs）作为种子细胞,整合ACECM源性取向支架,修复羊膝关节负重区软骨缺损的可行性。方法:（1）抽取羊髂骨骨髓血,体外分离骨髓基质干细胞（BMSCs）,培养扩增,并对培养的BMSC细胞进行成骨诱导,成脂肪诱导,成软骨诱导,确定其是具有多向分化能力的BMSCs（。2）将鉴定证实为具有正常表型的BMSCs与ACECM取向支架复合后继续培养,观察ACECM取向支架内细胞生长情况,并对细胞与支架复合效果进行鉴定。（3）于山羊股骨髁负重面制作一直径6mm全层软骨缺损,分别以:空白（缺损内未植入任何组织物）;单纯ACECM取向支架植入修复;BMSCs+ACECM取向支架植入修复三种方式治疗,并分别于术后3个月、6个月取材进行大体观察,组织学检查,病理评分和力学检测。结果:（1）由髂骨抽取的骨髓血分离、培养、扩增出来的骨髓基质干细胞向成骨方向诱导,经茜素红染色为阳性;向成脂肪诱导,经油红“O”染色为阳性;向软骨诱导,经蕃红“O”、甲苯胺蓝、II型胶原免疫组化染色均为阳性,证实扩增的细胞为具有多向分化能力的骨髓基质干细胞。（2）骨髓基质干细胞与支架复合后继续培养7天,做死活细胞染色,活细胞占95%以上。扫描电镜观察:细胞在取向支架上体外培养一周后见细胞大部分展开呈多角形,与支架粘附良好,有大量细胞基质的分泌,且广泛分布到支架内部,沿着支架的孔道分布排列成柱状结构,其横截面见细胞呈圆球形,均匀分布在支架孔道内。（3）BMSCs复合ACECM取向支架修复羊负重区关节面软骨缺损,从大体观察、组织学、力学等实验结果进行比较,单因素统计学分析,发现各组均有不同程度的组织修复,其中以BMSCs复合ACECM取向支架组效果最优,且与其它组比较有统计学意义。结论:（1）体外成功培养了表型稳定的羊骨髓基质干细胞。（2）骨髓基质干细胞在ACECM取向支架内生长状态良好,具有较好的亲和力,并能延孔道分化增殖,细胞在支架内的分布方式能按正常软骨细胞的方式分布生长。（3）利用ECM取向支架复合自体BMSCs,成功的构建了组织工程化软骨,并具有正常软骨组织的组织学和生化特性,较好的修复了大动物受损的关节软骨。