论文摘要
团头鲂（Megalobrama amblycephala）,俗称武昌鱼,隶属于鲤形目,鲤科,鳊亚科,鲂属,原产于我国,起初分布于长江中下游附属的湖泊,自1964年驯化成功后,因其存活率高、生长快、食草性、营养价值高、病害少和易捕捞等优点,现已推广到全国各地养殖。近年来,由于过度捕捞、水域污染和近亲交配,团头鲂种质出现严重退化和混杂现象,养殖群体出现性早熟、生长速度减慢和疾病增多等。目前对团头鲂的研究集中在生物学、免疫、疾病、营养及遗传育种等多个方面,而对团头鲂细胞培养方面的研究报道还很匮乏。因此本研究建立了团头鲂鳍条、肌肉和心脏细胞系,对3种细胞进行鉴定,并将其初步应用于病毒学、环境毒物检测和遗传学等领域。以期将这3种细胞系作为体外体系运用于团头鲂各方面的研究,为团头鲂的养殖和育种提供基础资料；运用于环境毒物检测,以确立敏感合适的细胞体外模型应用于毒物毒性的早期预警研究。具体内容及研究结果如下：（1）团头鲂三种细胞系的建立与鉴定用组织块贴壁法建立了团头鲂鳍条、肌肉和心脏细胞系,在一年多的时间内分别传代到95代、86代和71代以上,分别命名为MAF、MAM和MAH。3-6个月冻存后,MAF、MAM和MAH细胞复苏存活率分别为92.92±5.38%,90.04±5.49%和91.54±6.55%。MAF、MAM和MAH细胞适宜的生长温度为28-32-C,生长培养基为M199,培养基中血清浓度的添加量为10%。第10代的MAF、MAM和MAH细胞染色体数目为48分别占62%、59%和65%,说明3种细胞属正常二倍体细胞。30代MAF、MAM和MAH细胞的12s rRNA片段序列与已报道的团头鲂12srRNA序列一致率为99%-100%,表明3种细胞确实来自于团头鲂。60代MAF、MAM和MAH细胞与细胞角蛋白,纤连蛋白,结蛋白和Ki67抗体均呈阳性反应,表明3种细胞增殖能力强,呈现出上皮样和成纤维样混合状。（2）团头鲂鳍条细胞的初步应用以MAF细胞为研究对象,测定黑鱼棒状病毒（SHRV）,鲤春病毒血症病毒（SVCV）,斑点叉尾鮰病毒（CCV）和草鱼呼肠孤病毒（GCRV）对MAF细胞的敏感性实验。结果表明,MAF细胞对SHRV, SVCV和CCV较敏感,分别在感染后的1d、2d和2d出现典型的病变；MAF细胞对GCRV不敏感。PCR技术确认了MAF细胞被SHRV、SVCV和CCV感染,而不能被GCRV感染。SHRV、 SVCV和CCV在MAF细胞中病毒滴度分别达到108.2,106.8和105.9TCID50ml-1。MAF细胞对嗜水气单胞菌胞外产物敏感,24h细胞的形态即发生改变,细胞皱缩、变圆,最终整个单层脱落。MAF细胞对重金属铜也很敏感,24h半致死浓度为144.48±13.25μmol/L。用脂质体2000能成功将pEGFP-Nl转入到MAF细胞中,转染效率为5%。上述结果表明MAF作为体外体系能应用于病毒学、细胞生物学和遗传学等领域。（3）全氟辛酸对团头鲂肌肉细胞的毒性研究采用MTT法、细胞总蛋白含量（CP）、中性红摄取试验（NR）法和CCK-8试剂盒测定全氟辛酸对MAM细胞的毒性。实验结果表明：设定的全氟辛酸浓度都对MAM细胞的生长有抑制作用,且细胞存活率的降低与全氟辛酸浓度呈正相关。24h IC50值分别为240.81±10.66mg/L、243.96±11.65mg/L、248.63±13.95mg/L和223.62±13.97mg/L,48h IC50值分别为214.01±10.48mg/L、219.86±10.13mg/L、235.57±8.43mg/L和210.40±8.32mg/L,4种方法测定24h和48h IC50值的大小顺序为NR> CP>MT1>CCK-8,经分析4种方法测定的24h和48h ICso值没有显著性差异（P>0.05）。50mg/L和100mg/L全氟辛酸对MAM细胞暴露染毒后48h,MAM细胞不饱满,有皱缩的趋势,100mg/L组更明显；扫描电镜结果显示：50mg/L全氟辛酸暴露后,MAM细胞核变小,细胞中脂滴数量有增多的趋势,线粒体膨大,100mg/L组MAM细胞中的脂滴数量明显增加,线粒体膨大可以看到明显的嵴。表明全氟辛酸对MAM细胞的线粒体有损伤,并对其脂质代谢有影响。