人乳头瘤病毒16型E7病毒癌基因干扰细胞周期调控与宫颈癌关系的研究 ——携带HPV16 E7癌基因重组腺病毒基因组的构建及鉴定

论文摘要

目的 构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7病毒癌基因的重组腺病毒基因组,为重组腺病毒的包装打好基础,用于深入探讨E7干扰细胞周期调控的研究。 方法 ①采用氯仿-异戊醇抽提法提取临床证实为宫颈癌组织的DNA,PCR方法对所提DNA进行HPV16E7基因的筛选;②DNA Star软件辅助设计扩增HPV16 E7基因全长片段的引物,并在其3’和5’端分别引入Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位点的,PCR技术从HPV16 E7阳性的宫颈癌组织中获得目的基因片段;③构建携带目的基因（E7基因全长片段）的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7;④限制性内切酶Pme Ⅰ线性化重组穿梭质粒,并用碱性磷酸酶去磷酸化处理后,QIAquick PCR Purification Kit进行酶切产物的纯化;⑤采用1×TSS两步法将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转化E.coli BJ5183宿主菌,筛选阳性转化子,并鉴定;⑥将线性化的pAdTrack-CMV-E7转化新鲜制备的E.coli BJ5183感受态细菌（含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1）,利用RecA+宿主菌内的同源重组系统构建重组腺病毒基因组;⑦筛选转化子提取质粒并鉴定Ad-E7。 结果 ①PCR方法检测宫颈癌组织DNA中HPV16 E7基因,筛选出可用作模板的HPV16 E7阳性的宫颈癌组织;②PCR扩增出313bp大小的目的DNA条带;③酶切和PCR证实将条带连接入pMD18-T Vector进行了TA克隆,测序证实扩增的基因片段为HPV16 E7基因,碱基序列正确;④携带HPV16 E7基因的重组穿梭质粒构建成功:重组阳性质粒可用PCR方法扩增出313bp的DNA片段,Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶消化pAdTrack-CMV-E7,可产生两条DNA条带,分别为9.2kb和313bp,后者即为E7基因全长片段;⑤含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的RecA+ BJ5183宿主菌制备成功:将阳性转化子碱裂解提取质粒,用限制性内切酶Bam HI消化后产生两条带,分别为11.7kb和21.7kb;⑥携带HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒基因组构建成功:重组腺病毒基因组Ad-E7可用PCR方法扩增出313bp的片段;Ad-E7被Bam HI切成约24kb和12kb大小的两条带;被Pac Ⅰ切成一条大的约30kb和一条小的约3.0kb或4.5kb的带。 结论 ①采用PCR技术可以从HPV16 E7阳性的宫颈癌组织DNA中扩增出E7病毒癌基因全长片段。②通过分子克隆技术可以构建携带HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7。③利用高效的1×TSS两步转化法可以制备

论文目录

• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 主要仪器和设备
• 2.2 主要试剂及其配置
• 2.3 模板和目的基因的选择
• 2.4 目的基因的获取和纯化
• 2.5 重组穿梭质粒的构建
• 2.6 在RecA+BJ5183中构建重组腺病毒
• 3 结果
• 3.1 宫颈癌组织HPV16 E7基因的检测及目的基因的扩增结果
• 3.2 重组质粒pMD18-T-E7的鉴定结果
• 3.3 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7的鉴定结果
• 3.4 含有骨架质粒的BJ5183细菌的鉴定结果
• 3.5 重组腺病毒基因组Ad-E7的鉴定结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间的研究成果
• 致谢
• 学位论文独创性声明和学位论文知识产权权属声明
• 综述