枯草芽胞杆菌W003高产聚γ-谷氨酸的发酵工艺研究

论文摘要

聚γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是由微生物合成的阴离子型多聚谷氨酸，γ-PGA及其衍生物可以作为缓释剂、药物载体、增稠剂、保水剂以及生物絮凝剂等，可以广泛地应用于医药、食品、化妆品、水处理等领域。要实现γ-PGA的大规模应用，必须有高生产效率和较低的生产成本。本文以枯草芽胞杆菌W003为研究菌株，通过单因素实验与正交设计得到了一个合成培养基（g／L）：葡萄糖80，谷氨酸钠60，柠檬酸钠10，硫酸铵8．6，K2HPO41．05，MgSO4·7H2O 1．20，MnSO4·H2O 0．30；同时，通过单因素实验得到了优化的γ-PGA摇瓶发酵工艺：发酵温度37℃、初始pH 7．5、装液量70 mL、种龄10 h、接种量3％。利用优化培养基，在优化的摇瓶发酵工艺条件下，γ-PGA产量高达39．5 g／L，比优化前提高了102．6％。在3 L发酵罐中，优化了分批发酵工艺条件（搅拌转速、通气量和pH控制）。当搅拌转速为800 r／min、通气量2．0 L／L／min、用2 mol／L NaOH将发酵液pH控制为6．5时，经过30 h培养，γ-PGA浓度达到29．4 g／L。在分批发酵结果的基础上，为了进一步地提高γ-PGA产量，本文研究了葡萄糖补加工艺，初始葡萄糖浓度35 g／L，当18 h开始补加葡萄糖料液（浓度：350 g／L），补加速率0．60 mL／min，共补加150 mL葡萄糖料液，经过39 h培养，γ-PGA浓度达到39．1 g／L。另外，通过检测γ-PGA发酵过程中丙酮酸胞外代谢终产物以及胞内丙酮酸、柠檬酸、α-酮戊二酸和谷氨酸的浓度变化过程，初步揭示了葡萄糖补料发酵高产γ-PGA的机理。丙酮酸主要被代谢成乙酸、乳酸等副产物以及进入三羧酸循环；与分批发酵相比较，当采用葡萄糖补料策略时，发酵过程中更多丙酮酸进入三羧酸循环，被有效利用，只有较少的丙酮酸用于合成乙酸、乳酸等副产物；因此，葡萄糖补料能得到更高的γ-PGA产量。此研究结果为通过代谢调控手段进一步地提高γ-PGA产量提供一定的理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 聚γ-谷氨酸的结构、性质与应用
• 1.2 聚γ-谷氨酸的生产方式
• 1.3 聚γ-谷氨酸的微生物发酵法生产
• 1.3.1 聚γ-谷氦酸产生菌
• 1.3.2 聚γ-谷氨酸合成的相关代谢途径
• 1.3.3 聚γ-谷氨酸合成的营养需求
• 1.3.4 聚γ-谷氨酸的发酵工艺
• 1.4 本课题研究目的与意义
• 第二章 枯草芽胞杆菌W003产聚γ-谷氨酸的摇瓶发酵条件优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 γ-PGA含量的测定
• 2.2.6 菌体干重（Dry cell weight,DCW）的测定
• 2.2.7 培养基优化
• 2.2.8 摇瓶发酵工艺优化
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 培养基优化
• 2.3.2 摇瓶发酵工艺优化
• 第三章 3L发酵罐中聚γ-谷氨酸分批发酵与补料发酵工艺研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 菌种活化和种子培养
• 3.2.5 γ-PGA含量的测定
• 3.2.6 菌体干重（DCW）的测定
• 3.2.7 谷氦酸钠和葡萄糖含量的测定
• 3.2.8 柠檬酸钠含量的测定
• 3.2.9 分批发酵工艺优化
• 3.2.10 补料发酵工艺优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 分批发酵工艺优化
• 3.3.2 分批发酵过程曲线
• 3.3.3 葡萄糖补料发酵工艺优化
• 3.3.4 补料发酵过程曲线
• 3.4 小结
• 第四章 枯草芽胞杆菌W003胞内丙酮酸代谢以及葡萄糖补料高产聚γ-谷氨酸的机制
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 菌种活化和种子培养
• 4.2.5 分批发酵
• 4.2.6 补料发酵
• 4.2.7 检测样品制备
• 4.2.8 胞外有机酸和醇的检测
• 4.2.9 胞内有机酸含量的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 丙酮酸胞外代谢终产物的确定
• 4.3.2 葡萄糖补料发酵高产γ-PGA的机理研究
• 4.3.2.1 胞内丙酮酸浓度变化过程
• 4.3.2.2 胞内柠檬酸和α-酮戊二酸浓度变化过程
• 4.3.2.3 胞内谷氨酸浓度变化过程
• 4.4 讨论
• 第五章 小结与展望
• 5.1 小结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢