碱性芽孢杆菌γ-环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性及晶体结构初步研究

论文摘要

环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin Glycosyltransferase,简称CGT酶,EC 2.4.1.19）能通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精可与疏水性客体分子形成包合物,因此被广泛应用于食品、医药等领域。然而利用野生型CGT酶生产的均是α-、β-、γ-环糊精的混合物,需通过一系列的步骤才能从混合物中分离纯化出单一类型的环糊精,导致其生产成本高,限制了其大规模应用。为了研究CGT酶产物特异性的分子机制,选用产物特异性高的碱性芽孢杆菌γ-CGT酶为研究对象,将其在Escherichia coli BL21（DE3）中进行了胞外表达,然后对亚位点-7处6个氨基酸的缺失对产物特异性的影响进行了分析。为了深入研究γ-CGT酶三维结构与产物特异性之间的关系,通过X-衍射晶体学的方法对其结构进行了初步解析。主要研究内容如下:（1）将γ-CGT酶基因与带有OmpA信号肽的质粒pET-20b（+）连接,构建表达载体pET-20b（+）/γ-cgt,并将其转入表达宿主E. coli BL21 （DE3）。E. coli BL21 （DE3） （pET-20b （+）/γ-cgt）在TB培养基,25℃,200 rpm摇瓶发酵72 h后,其胞外环化活力为4 U/mL。（2）重组γ-CGT酶带有6×His标签,因此先使用镍离子亲和色谱柱进行纯化,但目的蛋白不能有效地结合到色谱柱上。选用阴离子交换和疏水相互作用色谱柱对目的蛋白进行分离纯化,最终得到了电泳纯蛋白。（3）运用重叠PCR的方法,在γ-CGT酶亚位点-7处添加6个氨基酸,造成插入突变。将突变基因与pET-20b（+）连接并在E. coli BL21（DE3）中表达。对其突变前后产物特异性进行分析发现,突变酶转化生成的3种环糊精中,γ-环糊精所占的比例从76.0%降至12.5%,而α-、β-环糊精分别从8.7%和15.2%提高至37.5%和50%。（4）在20℃条件下采用座滴气相扩散法进行晶体的培养和筛选,通过初筛和复筛,最终得到两种晶型较好的晶体。在上海同步衍射中心收集到一套分辨率为1.65?的衍射数据,用HKL2000进行数据处理,然后运用分子置换法,成功解析得到γ-CGT酶的晶体结构。（5）解析得到的γ-CGT酶晶体结构与蛋白质结构数据库中保存的CGT酶结构进行比对发现,在亚位点-7处,β-CGT酶的环状结构较大,而γ-CGT酶的环状结构较小。突变前,野生型γ-CGT酶亚位点-7处较小的环状结构使得底物结合凹槽空间较大,从而为较长葡萄糖链的结合提供了足够的空间,因此这种构象更适合于γ-环糊精的生成。突变后,这6个氨基酸会与相应的葡萄糖残基相互作用,使得葡萄糖链所能结合的空间变小,从而限制了较长葡萄糖链的结合,因此这种构象不利于γ-环糊精的生成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 环糊精概述
• 1.1.1 环糊精的组成与结构
• 1.1.2 环糊精的功能与应用
• 1.2 环糊精葡萄糖基转移酶（CGT 酶）概述
• 1.2.1 CGT 酶的功能及其在工业中的应用
• 1.2.2 CGT 酶结构的研究进展
• 1.2.3 CGT 酶的催化机理
• 1.3 CGT 酶产物特异性的研究进展
• 1.3.1 产物特异性对环糊精生产的重要意义
• 1.3.2 产物特异性的研究现状
• 1.4 蛋白质晶体学原理与方法
• 1.4.1 X 射线晶体学基本原理
• 1.4.2 蛋白质晶体学的研究方法
• 1.5 立题依据及意义
• 1.6 本论文主要研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 菌种和质粒
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 2.4 菌体培养方法
• 2.4.1 培养基
• 2.4.2 种子培养
• 2.4.3 摇瓶发酵
• 2.5 分子生物学操作
• 2.5.1 重组表达载体的构建
• 2.5.2 重叠PCR
• 2.5.3 质粒DNA 的酶切验证
• 2.5.4 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 2.5.5 目的基因与载体的连接
• 2.5.6 胶回收目的片段
• 2.5.7 E. coli 化学感受态细胞的制备
• 2.5.8 热激转化
• 2.6 分析方法
• 2.6.1 α-环化活力的测定
• 2.6.2 β-环糊精形成活力的测定
• 2.6.3 γ-环糊精形成活力的测定
• 2.6.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测表达产物
• 2.6.5 环糊精浓度的测定
• 2.6.6 蛋白质浓度的测定
• 2.6.7 重组CGT 酶的纯化
• 2.7 晶体结构解析
• 2.7.1 晶体生长与数据收集
• 2.7.2 晶体结构解析与分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 γ-CGT 酶的克隆与表达
• 3.1.1 γ-CGT 酶的克隆表达
• 3.1.2 重组γ-CGT 酶的胞外表达
• 3.1.3 重组γ-CGT 酶的纯化
• 3.2 亚位点-7 处的突变对γ-CGT 酶产物特异性的影响
• 3.2.1 γ-CGT 酶产物特异性位点分析
• 3.2.2 突变体的克隆表达
• 3.2.3 突变体的最适温度和最适pH
• 3.2.4 突变体的产物特异性
• 3.3 γ-CGT 酶晶体的培养及其晶体结构的解析
• 3.3.1 γ-CGT 酶晶体的培养
• 3.3.2 γ-CGT 酶晶体衍射数据的收集和数据处理
• 3.3.3 γ-CGT 酶晶体结构的解析
• 3.3.4 B. clarkii 7364 γ-CGT 酶整体结构
• 3.3.5 亚位点-7 处氨基酸对γ-CGT 酶产物特异性影响的作用机理分析
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文