高机械指数超声造影对结肠癌肝转移影响的实验研究

论文摘要

背景目前普遍认为,肿瘤的生长存在两个明显不同的阶段,即无血管的缓慢生长阶段和有血管的快速生长阶段。前者主要依靠弥散供氧,氧的最大弥散距离为150μm,当肿瘤直径超过1-2mm时,其继续生长就需要血液供应。研究发现,绝大多数实体瘤在缺少血管的情况下,生长扩散受到了极大限制,在有血管的情况下,其瘤体增长迅速。正常人体的血管内皮细胞倍增时间为一年,而肿瘤的血管内皮细胞倍增时间仅四天。因此,阻断肿瘤血供,从而抑制肿瘤的生长是目前研究的热点之一。恶性肿瘤肝转移的途径主要是通过局部扩散转移、淋巴道转移、血道转移和癌细胞脱落形成种植转移等。肝脏是人体最大的实质性脏器,门静脉及肝动脉双重血液供应的特点使其成为许多恶性肿瘤转移的主要部位。而结肠癌引起的肝转移又是肝脏最常见的血道转移方式。文献报道约10%～25%的结直肠癌患者在接受原发灶的手术治疗时已经出现了肝转移,另有约25%的患者在术后随访中发现肝转移,50%以上的结直肠癌最终发生肝转移,而肝转移是结直肠癌死亡的主要因素之一。因此,抑制结肠癌肝转移是提高结肠癌远期疗效的关键问题之一。近几年,随着超声造影技术的发展和新型超声造影剂的面市,关于微泡造影剂生物学效应的问题也逐渐引起人们的重视,超声造影在肝脏疾病诊断中得到了较广泛的应用,并取得了长足的进步。超声的物理特性和生物学效应（热效应、空化效应、机械效应等）的运用已渗透到了人体保健、疾病预防、疾病治疗（包括体外碎石、止血、肿瘤切除等）、生物技术（如基因转染）等医学领域。超声造影微泡不仅作为一种人为的空化核,降低超声的空化阈值,增强空化效应,并减少产生空化效应所需的超声能量;超声空化效应本身对周围组织细胞可产生各种生物学效应,运用高机械指数超声造影对原发灶进行间歇辐照,增强超声空化效应,可能对结肠癌肝转移产生抑制效应。目的本实验在建立转移性肝癌动物模型的基础上,采用高机械指数超声造影对其原发灶进行间歇辐照,希望通过微泡增强的空化效应,引起肿瘤组织及其周围肿瘤微血管的破坏。并经体外实验观察对肿瘤细胞迁移运动、增殖、凋亡、以及细胞微丝、微管等细胞骨架的影响,进一步探讨高机械指数超声造影增强空化效应,是否能够导致肿瘤肝转移的数目及大小的改变,为抑制肿瘤肝脏转移探索新的手段。方法1.高机械指数超声造影对结肠癌肝转移动物体内的实验研究:（1）转移性肝癌动物模型的制备:结肠癌Lovo细胞常规培养于含10%灭活的胎牛血清的DMEM培养液中,取对数生长期的细胞作为实验研究。研究对象为62只正常雄性SD大鼠（体重200～250g）,其中10只在SD大鼠脾脏直接接种结肠癌Lovo细胞后第2天、第4天及第6天分别脱颈处死,解剖SD大鼠肝脏,观察转移灶的数目及大小,确定最佳辐照时间。（2）实验分组:随机分为4组（对照组、微泡+超声组、单纯超声组和单纯微泡组）,每组12只。其中微泡+超声辐照组的SD大鼠在接种结肠癌Lovo细胞第4天时,用8%的硫化钠给予SD大鼠腹部脱毛,1%戊巴比妥钠40mg/kg进行腹腔注射麻醉,将SD大鼠仰卧固定于木板上,经尾静脉注入SonoVue造影剂（1ml/kg）后,用高频探头寻找脾脏定位后,转换为相控阵探头,将探头置于SD大鼠脾脏处,固定频率为1.5MHz,机械指数为1.7,显像深度固定在4cm。经SD大鼠尾静脉快速推注SonoVue造影剂（1ml/kg）,随后推注1ml生理盐水冲洗管道,辐照6s,间歇6s,共20次。（3）将分组处理后的SD大鼠肝脏及脾脏采用HE染色,进行病理组织学检查及透射电镜观察其超微结构的变化。2.高机械指数超声造影对恶性肿瘤影响的体外实验:（1）结肠癌Lovo细胞常规培养于含10%灭活的新生小牛血清的DMEM培养液中,取对数生长期细胞,观察细胞折光性强,将其分为4组（对照组、微泡+超声组、单纯超声组和单纯微泡组）,其中微泡+超声组在采用ViVid Five型彩色多普勒超声仪,调节超声探头频率为1.5MHz,机械指数为1.7,显像深度固定在4cm,用医用胶带将探头环形缠绕呈现一凹槽,将耦合剂置于槽内,使得培养板与耦合剂充分接触,超声辐照6s,间歇6s,共20次。（2）采用细胞迁移运动试验（Transwell法）和激光共聚焦显微镜检测细胞迁移运动能力及对结肠癌Lovo细胞微丝、微管的影响。（3）细胞增殖试验（MTT法）检测肿瘤细胞增殖活性的变化。（4）流式细胞仪检测结肠癌细胞周期及凋亡,观察G1期、S期及G2/G1期细胞比例的变化。结果1.高机械指数超声造影对结肠癌肝转移影响的动物实验研究显示:（1）将62只正常雄性SD大鼠,其中10只经脾脏直接接种结肠癌Lovo细胞后第2天、第4天及第6天分别脱颈处死,解剖SD大鼠肝脏,发现在接种结肠癌Lovo细胞第4天即可见少数白色结节转移灶,直径在1-2mm左右,取此时为最佳辐照时间。余52只SD大鼠除4只因麻醉意外死亡,其余48只纳入实验研究,而其中41只于接种结肠癌Lovo细胞14天后,解剖肝脏均发现直径1～5mm的白色结节状转移灶,成功率为85.4%。（2）分组处理后10天,将SD大鼠脱颈处死,对照组肝脏可见多个局灶性灰白色的微小转移灶、病灶直径在2～5mm之间。微泡+超声辐照组肝脏可见肿瘤微小转移灶的数目明显减少,直径均在1～2mm之间。微泡+超声辐照组与对照组比较肿瘤数目及大小显著减少（P<0.01）,单纯超声组及单纯微泡组与对照组比较肿瘤数目、肿瘤大小差异没有显著意义（P>0.05）。（3）将对照组、微泡+超声组、单纯辐照组及单纯微泡组分组处理后10天,解剖SD大鼠肝脏及脾脏作病理学检查。各组大鼠肝脏内均有肿瘤细胞生长,瘤细胞多呈圆形或椭圆形,呈团状分布,但在微泡+辐照组肝脏肿瘤细胞明显减少,脾脏组织内出现大片出血坏死及明显血栓形成,对照组、单纯辐照组及单纯微泡组的血栓数量明显少于微泡+超声组。（4）透射电镜观察脾脏组织超微结构的改变:对照组透射电镜可见肿瘤细胞核大,胞浆和胞核比例减小,线粒体较多,未见肿胀。内皮细胞形态规则,之间连接紧密,线粒体正常。微泡+超声组透射电镜可见明显的超微结构的破坏,肿瘤细胞除具有对照组特点之外,线粒体明显肿胀,呈球状。内皮细胞形态多样,紧密连接断开,线粒体肿大。单纯超声组、单纯微泡组与对照组之间无显著差别。2.高机械指数超声造影对结肠癌Lovo细胞迁移运动、增殖及凋亡的影响:（1）采用Transwell法发现,对照组Lovo细胞数发生明显迁移,而进行微泡+超声辐照后Lovo细胞迁移数明显减少（P<0.01）,微泡+超声辐照组可见大量悬浮不透亮的死亡细胞;而单纯超声组细胞迁移数和单纯微泡组的细胞迁移数目与对照组比较,无显著差异（P>0.05）。（2）用激光共聚焦显微镜检测各组,细胞内微丝蛋白F-actin的表达,结果显示:对照组微管染色表现为细胞致密的丝状网络结构,向细胞边缘呈放射性延伸;单纯超声组与单纯微泡组与对照组无明显差别;微泡+超声组微管表达较对照组减弱、稀疏,网络样结构主要沿细胞长轴排列。对照组细胞微丝染色表现为细胞致密网络状细丝样结构,向四周伸出许多细短的毛刺状突起,有明显的拉丝状和方向性;单纯超声组与单纯超声微泡组与对照组无明显差别;微泡+超声组Lovo细胞胞质中部的网络状细丝明显减少,荧光暗淡,细短的毛刺状突起明显减少。（3） MTT法检测细胞增殖活性结果显示,对照组细胞PI增殖指数明显多于微泡+超声组（P<0.01）,而单纯超声组细胞增殖数和单纯微泡组的细胞增殖指数与对照组比较,无显著差异（P>0.05）。（4）流式细胞仪检测各组结肠癌Lovo细胞周期及凋亡的改变,结果显示:对照组G1期细胞比例显著降低（P<0.01）,而S期细胞比例显著增高（P<0.01）;单纯超声组和单纯微泡组与对照组各细胞周期的比例无显著差异（P>0.05）;与对照组相比,微泡+超声辐照组G1期细胞比例显著增高（P<0.01）,S期细胞比例显著降低,且凋亡峰与对照组相比较明显增高（P<0.01）。结论1.高机械指数超声造影能够引起转移性肝癌的数目、大小发生改变,抑制肿瘤肝转移;2.高机械指数超声造影能够引起原发肿瘤组织坏死,促进肿瘤内部及周围组织微血栓形成,使肿瘤细胞超微结构发生变化;3.高机械指数超声造影能够抑制结肠癌Lovo细胞迁移,引起细胞骨架的改变;4.高机械指数超声造影能引起结肠癌Lovo细胞周期的改变,并可诱导结肠癌Lovo细胞凋亡、抑制增殖。

论文目录

• 主要英文缩写词简表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 高机械指数超声造影对结肠癌肝转移影响的实验研究
• 前言
• 第一部分 高机械指数超声造影对结肠癌肝转移影响的体内实验的研究
• 前言
• 分题一 结肠癌细胞培养及转移性肝癌动物模型的建立
• 材料与方法
• 结果
• 分题二 高机械指数超声造影对结肠癌肝转移的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 高机械指数超声造影对结肠癌细胞影响的体外实验的研究
• 前言
• 分题一 高机械指数超声造影对结肠癌细胞的迁移、运动能力的影响
• 材料与方法
• 结果
• 分题二 高机械指数超声造影对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 转移性肝癌影像学诊断及非手术治疗效果评价的研究进展
• 参考文献
• 在读硕士期间发表的文章