论文摘要
在HIV的感染过程中,首先是HIV包被膜与靶细胞的细胞膜发生融合。HIV与靶细胞融合主要由包膜糖蛋白gp160（由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共价结合形成）介导。gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体（趋化因子受体CCR5或CXCR4等）依次结合,导致gp41的构型发生改变,形成六股α-螺旋束核心结构,将病毒包膜与靶细胞膜拉近并发生融合,完成病毒进入靶细胞的感染过程。因此,抑制融合过程中的任何一个环节,就能抑制HIV进入靶细胞,从而预防和治疗HIV的感染。gp120、gp41、CD4、趋化因子受体（CXCR4或CCR5等）均可作为HIV进入抑制剂的药物作用靶点。目的:从马尾树科植物马尾树中提取三萜类化合物,从蛇菰科植物日本蛇菰中提取葡萄糖类化合物,筛选鉴定能有效抑制HIV gp41六螺旋束结构形成的中草药来源小分子化合物。方法:用萃取和柱层析方法分离提纯三萜类化合物和葡萄糖类化合物,用酶联免疫测定法（ELISA）、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（N-PAGE）、分子排阻高效液相色谱法（SE-HPLC）检测其抑制HIV gp41六螺旋束结构形成的活性,用细胞-细胞融合方法检测化合物抑制HIV进入靶细胞的活性。N36和C34是从HIVgp41的NHR和CHR区衍生出来的多肽,二者在体外能形成类似gp41 NHR和CHR结合的螺旋结构。因此,抗gp41六螺旋束核心结构的活性可以用抑制N36和C34结合的作用来测定。结果:我们从马尾树科植物马尾树的树皮中提取三萜类化合物,获得五个单体成分即蜡果杨梅酸B（myriceric acid B,R-3）、蜡果杨梅酸C（myriceric acidC,DR-22B）、蜡果杨梅酸B甲酯（myriceric acid B methyl ester,R3-Me）、chilianthin A（R-1）、chilianthin D（DR-22A）。首先我们应用基于抗原抗体反应的ELISA法对这些化合物进行了筛选,发现蜡果杨梅酸B（myriceric acid B,R-3）、chilianthin D（DR-22A）、蜡果杨梅酸C（myriceric acid C,DR-22B）具有较好的抑制HIV gp41六螺旋束结构形成作用,IC50分别为7.22±0.25μg/ml、3.2±0.41μg/ml、4.01±0.54μg/ml,阳性对照化合物ADS-J1和90%TF的IC50分别为3.5±0.20μg/ml和5.00±0.12μg/ml。随后我们应用了两种生物物理方法,即天然凝胶电泳（N-PAGE）和分子排阻高速液相色谱（SE-HPLC）,对这三个三萜类化合物抑制六螺旋束结构形成活性进行进一步的确证。N-PAGE法能根据多肽的分子量和荷电特性对其进行分离,在加入三萜类化合物R-3、DR-22A、DR-22B后能够明显抑制gp41六螺旋束结构条带的形成,表明这三个化合物能够靶向HIV gp41并抑制六螺旋束结构的形成,抑制强度与ELISA法的结果一致。应用SE-HPLC法检测三萜类化合物蜡果杨梅酸B（R-3）、chilianthin D、蜡果杨梅酸C（DR-22B）对HIV gp41六螺旋束结构形成的抑制作用可通过比较六螺旋束峰的峰面积来确定。在加入三萜类化合物R-3、DR-22A、DR-22B后能够明显降低六螺旋束峰的峰面积,且强度与前面的ELISA法和N-PAGE法相似。这充分说明了这三个三萜类化合物能够作用于HIV gp41抑制其形成六螺旋束结构,可能也在抑制HIV与靶细胞融合中发挥作用。我们还从蛇菰科植物日本蛇菰地下和地上部分提取葡萄糖类单体化合物,分离得到1-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖（1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose,BJ-821）、松柏苷（Coniferin,BJ-83）、1-O-香豆酰基-β-D-吡喃葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose,BJ-842）、1,2-双-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖（1,2-Di-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose,BJ-86284）、1,2,6-三-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖（1,2,6-Tri-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose,BJ-862D）、1,3-双-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖（1,3-Di-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose,BJ-851）、1,3-双-O-咖啡酰基-4-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖（1,3-Di-O-caffeoyl-4-O-galloyl-β-D-glucopyranose,BJ-8525）、1-O-咖啡酰基-3-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（1-O-caffeoyl-3-O-galloyl-β-D-glucose,BAT-17）、1,2,6-三-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖（1,2,6-Tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose,1,2,6-Tri）等9个单体化合物。同样应用了ELISA法、N-PAGE法及SE-HPLC法检测了其抑制HIV gp41六螺旋束结构形成的活性。在ELISA法中,BJ-862D、BJ-8525、1,2,6-Tri对HIV gp41六螺旋束结构形成具有较强的抑制作用,IC50分别为2.00±0.35μg/ml、0.83±0.16μg/ml、1.37±0.19μg/ml。进一步用N-PAGE和SE-HPLC也验证了其抑制六螺旋束结构形成的活性,且强度与ELISA法的相近。本研究还检测了1,2,6-Tri抑制HIV包膜介导的细胞-细胞融合的活性,表明其可能抑制HIV与靶细胞的融合。结论:通过对提取的三萜类和葡萄糖类化合物的筛选及其活性测定,我们得到了几个靶向HIV gp41并抑制其六螺旋束结构形成的化合物。这些化合物都富含苯环结构及酚羟基基团。其苯环结构可与靶穴中保守的疏水残基结合,而酚羟基所带的弱碱性,可能与靶穴中保守的正电荷残基K574结合,从而抑制gp41六螺旋束结构的形成。本研究为从中草药等天然产物来源寻找HIV进入抑制剂提供了借鉴和思路。
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