应用cDNA芯片研究水稻杂种与亲本基因表达谱及杂种优势分子生物学基础

论文摘要

杂种优势利用是提高动植物产量和节约土地资源的主要措施之一，在玉米和水稻等多个物种上取得了辉煌的成就。尽管对杂种优势进行了大量遗传研究，但杂种优势的生物学机理仍阐释不全面，因此，深入探索杂种优势的分子机理对于作物遗传改良和育种实践具有重要意义。杂种优势现象是杂合子基因表达调控的一种外在表现形式，已有研究证实从基因表达调控水平研究基因表达差异与杂种优势的关系是探索杂种优势生物学机理的重要途径。基因芯片是一种能从基因组水平上研究基因表达的高通量技术，它被广泛用于重要物种的基因表达谱研究。水稻苗期是茂盛营养体建成的基础阶段，幼穗分化期是稻穗分化大小的关键时期，研究水稻苗期和穗分化期杂种与亲本间基因表达差异很有代表性，能为基因表达水平上阐释杂种优势的分子机理提供重要信息。本研究采用本实验室自制的包含9198条非重复EST序列的芯片，研究生产上大面积种植的优良水稻杂交组合汕优63和两优培9的杂种与亲本发芽后72h、四叶期的根和幼苗以及汕优63组合幼穗分化期(二次枝梗原基分化期期、雌雄蕊原基分化期和花粉母细胞形成期)幼穗中基因表达情况，建立基因表达谱，筛选出杂种与亲本间差异表达的基因，分析基因表达模式，结合本实验室已有的实验数据，鉴别杂种中可能与幼苗和穗分化以及杂种优势有关的代谢途径中潜在的候选基因，从转录水平上揭示杂种与亲本间基因差异表达与杂种优势的关系，为揭示作物杂种优势形成机理提供分子生物学证据。采用Quantile和Loess平衡化方法处理原始数据。两优培9和汕优63组合三个基因型苗期根和幼苗中共有9048条和8652条序列、汕优63幼穗分化期有8422条序列至少在一种组织中检测到杂交信号。在p＜0.05显著水平进行ANONA和LSD测验并结合100次随机抽样验证，鉴别出两优培9和汕优63组合分别有1139(12.6％)条和1283(14.8％)条序列在三个基因型的根和幼苗、438(5.2％)条序列在汕优63组合幼穗分化期存在表达多态性(p＜0.05)。苗期根和幼苗中，两优培9和汕优63组合分别有921(80.8％)条和1205(93.9％)条序列、幼穗中有340条序列在杂种和亲本之一或双亲间存在表达多态性；174条序列在两优培9和汕优63苗期幼苗和根中、75条序列在汕优63苗期和幼穗中存在表达多态性。从两个杂交组合苗期多态性表达序列中选取7条序列进行Northern验证，基因表达丰度变化与芯片检测结果有较好的一致性。采用中亲优势数值对多态性表达序列进行h统计测验表明：两优培9和汕优63组合苗期分别有78(8.5％)条和51(4.2％)条、汕优63组合幼穗中有141(32.2％)条多态性表达序列存在显著的(p＜0.05)杂种优势。两优培9和汕优63组合苗期根中正向优势表达序列多于负向优势表达序列，而幼苗中负向优势表达序列多于正向优势表达序列，汕优63组合幼穗中负向优势表达序列多于正向优势表达序列。经过同源性比较，幼穗分化期438条差异表达序列中，436条序列定位在12条染色体上，覆盖了282.0 cM水稻基因组，其中64条差异表达序列定位在26个QTL区间，这些OTLs与一次枝梗数、一次枝梗着生小穗数、二次枝梗数、二次枝梗着生小穗数和每穗小穗数5个穗部性状相关。功能分析表明：cDNA芯片上～50％序列功能已知，苗期差异表达的功能己知序列中，代谢相关基因最多，其次是遗传信息处理相关基因，而幼穗分化期差异表达的功能己知序列中遗传信息处理相关基因最多，其次是代谢相关基因；两个发育阶段的差异表达序列中，环境信息处理相关基因较前两类基因少，细胞生长发育相关基因最少。x~2测验表明：汕优63组合苗期和幼穗分化期差异表达基因与功能类型没有明显相关性，而两优培9组合苗期差异表达基因与功能类型存在明显相关，其中碳水化合物代谢和逆境应答相关基因观测数量明显高于期望数量，而次生代谢和转录调节相关基因的观测值明显低于期望值，意味着差异表达序列分布与这些功能类别密切相关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 植物杂种优势及其利用现状
• 1.1 杂种优势概念
• 1.2 植物杂种优势利用历史与现状
• 2 植物杂种优势遗传机理研究进展
• 2.1 杂种优势经典理论
• 2.1.1 显性假说
• 2.1.2 超显性假说
• 2.2 植物杂种优势理论研究新发展
• 2.2.1 上位性效应和杂种优势
• 2.2.2 基因网络系统与杂种优势
• 2.2.3 亲本间遗传差异与杂种优势预测
• 2.2.4 杂种优势分子数量遗传学解析
• 2.2.5 基因差异表达与杂种优势
• 2.2.6 后成修饰与杂种优势
• 2.2.6.1 DNA修饰
• 2.2.6.2 组蛋白乙酰化/去乙酰化
• 2.2.6.3 非编码RNA调控
• 3 植物杂种优势研究新方法
• 3.1 mRNA差异展示技术
• 3.2 cDNA-AFLP技术
• 3.3 基因表达系列分析
• 3.4 GENECALLING
• 3.5 生物芯片技术
• 3.5.1 生物芯片在生命科学研究中的应用
• 3.5.2 生物芯片应用前景
• 3.5.3 生物信息学
• 4 本研究的目的意义和主要研究内容
• 材料与方法
• 1 水稻实验材料和样品采集
• 1.1 实验材料及其特性
• 1.2 实验材料种植
• 1.3 农艺性状调查
• 1.4 水稻幼穗分化进程观察
• 1.5 样品采集
• 1.6 总RNA、mRNA分离
• 2 芯片制作
• 2.1 cDNA文库构建
• 2.2 芯片文库组建
• 2.3 芯片文库质粒分离
• 2.4 芯片目标探针扩增
• 2.5 CDNA芯片点制
• 3 cDNA芯片杂交
• 3.1 探针制备
• 3.2 芯片杂交
• 3.3 芯片洗涤和扫描
• 3.4 数据分析
• 3.5 差异表达基因验证
• 结果分析
• 1 汕优63及其亲本苗期基因表达差异分析
• 1.1 苗期性状表现
• 1.2 苗期芯片杂交概况
• 1.2.1 RNA质量检测和mRNA分离
• 1.2.2 汕优63组合苗期芯片杂交总体情况
• 1.3 芯片杂交可靠性检验
• 1.4 基因表达多态性
• 1.5 差异表达基因功能分类
• 1.6 基因差异表达时空特点
• 1.6.1 幼苗中差异表达基因
• 1.6.2 根中差异表达基因
• 1.6.3 根和幼苗中差异表达基因
• 1.7 苗期基因表达中亲优势和优势表达基因功能分类
• 1.8 苗期优势表达基因的表达模式和功能分类
• 2 两优培9及其亲本苗期基因表达差异分析
• 2.1 苗期性状表现
• 2.2 苗期芯片杂交概况
• 2.2.1 RNA质量检测
• 2.2.2 两优培9组合苗期芯片杂交总体情况
• 2.3 芯片杂交可靠性检验
• 2.4 基因表达多态性
• 2.5 差异表达基因功能分类
• 2.6 基因差异表达时空特点
• 2.6.1 幼苗中差异表达基因
• 2.6.2 根中差异表达基因
• 2.6.3 根和幼苗中差异表达基因
• 2.7 基因表达中亲优势和优势表达基因功能分类
• 2.8 苗期优势表达基因的表达模式和功能分类
• 2.9 两个杂交组合苗期基因表达差异比较
• 3 幼穗分化期基因表达差异分析
• 3.1 汕优63组合穗部性状表现
• 3.2 RNA质量检测
• 3.3 幼穗分化期芯片杂交概况
• 3.4 幼穗分化期基因表达模式
• 3.5 幼穗分化期基因表达多态性
• 3.6 基因型间差异表达基因功能分类
• 3.7 幼穗分化期基因表达中亲优势和优势表达基因功能分类
• 3.8 幼穗分化期优势表达基因的表达模式
• 3.9 幼穗分化期差异表达基因与穗部性状QTL的对应关系
• 3.10 汕优63组合苗期和幼穗分化期基因表达比较分析
• 讨论
• 1 基因芯片用于杂种优势研究的有效性
• 2 基因差异表达与杂种优势的潜在关系
• 2.1 基因表达多态性
• 2.2 基因表达多态性的时空性
• 2.3 特异等位基因表达与杂种优势
• 2.4 基因优势表达
• 2.5 基因表达多态性与杂种优势预测
• 2.6 多态性表达基因与QTLs的对应关系
• 3 基因芯片在杂种优势研究中的应用前景
• 杂种优势分子生物学机理进一步研究设想
• 1.从DNA水平研究杂种优势
• 2.基因表达多态性与杂种优势
• 3.蛋白质水平上研究杂种优势的遗传机理
• 4.植物激素与杂种优势
• 5.转录因子与杂种优势
• 参考文献
• 附件Ⅰ 实验操作指南
• AppendixⅠ Protocols
• Protocol1 Total RNA extraction
• Protocol2 Purification mRNA from total RNA
• Protocol3 cDNAmicroarray probe preparation
• Protocol4 cDNAmicroarray hybridization
• Protocol5 Formaldehyde Gel Electrophoresis of RNA for Northern Blot
• 附录Ⅱ 简历
• AppendixⅡ CurriculumVitae
• 致谢