对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因的表达及其重组蛋白抗病性研究

论文摘要

对虾白斑综合征（WSS）是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一，至今已席卷了世界各国的对虾养殖地区，造成了巨大的经济损失。但目前尚无有效的防治手段。因此，预防和控制疾病方面的研究正成为热点。本研究主要在大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达系统中表达了对虾白斑综合征病毒（WSSV）的囊膜蛋白VP28，比较了原核表达产物和真核表达产物保护克氏原螯虾抵抗WSS的效果。主要研究内容和结果如下：1)用蔗糖垫层差速离心法从人工感染的螯虾中分离纯化了WSSV。完整病毒粒子长约360～420nm，直径约80～120nm，而核衣壳长约320～400nm，直径约80～90nm。通过对纯化的WSSV进行SDS-PAGE分析发现至少存在12个大小不同的蛋白条带。这与报道的结果相似，说明本研究所分离的病毒确实是WSSV。2)利用PCR技术，扩增和克隆得到了完整的囊膜蛋白VP28基因（GenBank登录号为DQ098011），基因序列全长为615bp，编码204个氨基酸。与已登录GenBank的几个不同地理分离株的同源性均在99％以上。通过对预测的204个氨基酸进行DNATools 5.1分析表明VP28基因序列存在多个可能的糖基化位点。3)VP28基因在大肠杆菌中进行表达，并用Ni-NTA柱纯化后，分别用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白分析。结果显示其表达产物均出现了明显的特异性条带，而且大小与预测的一致，表明VP28基因在大肠杆菌中进行了有效的融合表达。但重组得到的VP28蛋白分子量比在纯化病毒中分离得到的蛋白分子量小，暗示着在大肠杆菌中重组VP28蛋白得不到转译后的修饰。4)为获得与天然结构相近的表达产物，本研究采用了Bac-to-Bac杆状病毒表达系统。VP28基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA后，经转座形成重组Bacmid-VP28。提取重组Bacmid-VP28 DNA转染Sf9昆虫细胞进行表达。表达产物分别用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白分析。结果表明，VP28基因在昆虫细胞中进行了有效的表达。重组得到的VP28蛋白分子量比理论推导的分子量大约6kDa，但与在纯化病毒中分离得到的蛋白分子量大小一致，这暗示着在昆虫细胞中表达的重组VP28蛋白得到了转译后的修饰。5)在摸索WSSV感染螯虾的水温条件时发现在18℃～28℃之间，随着水温的升高，死亡率也有增大的趋势。但高水温（30℃）能抑制WSSV对螯虾的侵袭。竞争性PCR分析结果表明在室温（24±1℃）条件下WSSV的病毒拷贝数从感染后12h的104／mg迅速上升到96h的1010／mg，而在高温（32±1℃）条件下WSSV的病毒拷贝数却一直保持在105／mg左右。这说明高温并没有清除患病螯虾体内的病毒粒子，而只是抑制了病毒的复制。6)为了研究囊膜蛋白VP28的结构是否对其抗病性产生影响，从大肠杆菌表达获得的重组VP28蛋白（pET-VP28）和从昆虫细胞表达的重组VP28蛋白（AcNPV-VP28）分别通过肌肉注射免疫螯虾。10d后注射一定浓度的WSSV进行攻毒，然后通过记录死亡率来评估VP28蛋白的保护效果。试验结果表明，AcNPV-VP28免疫的螯虾死亡率与其对照组AcNPV相比，平均相对存活率（RPS）达89％，而pET-VP28免疫组与对照组pET-30a相比，平均RPS仅为35％。这一结果表明注射免疫重组囊膜蛋白VP28能诱导螯虾产生抗病毒作用，而且从昆虫细胞中表达获得的重组VP28蛋白的抗病性要明显好于从大肠杆菌中获得的重组VP28蛋白。这暗示着可能存在的转译后修饰从而折叠正确的蛋白抗原能给螯虾带来更强的免疫反应，从而产生更好的抗WSSV保护作用。

论文目录

• 本文主要英文缩写词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一篇 文献综述
• 1 对虾白斑综合征研究进展
• 1.1 WSS的症状
• 1.2 WSSV的感染宿主、感染途径及动物模型
• 1.3 WSSV的形态结构及理化特性
• 1.4 WSSV分子生物学进展
• 1.5 WSS的诊断
• 1.6 对虾白斑综合征病毒的防治研究
• 2 甲壳动物的免疫反应
• 2.1 细胞免疫
• 2.2 体液免疫
• 3 杆状病毒表达系统
• 3.1 杆状病毒表达系统的原理
• 3.2 杆状病毒表达系统的发展
• 3.3 杆状病毒表达系统的优缺点
• 3.4 杆状病毒表达系统的应用
• 4 本论文的研究目的和意义
• 第二篇 对虾白斑综合征病毒的分离纯化
• 1 试验材料
• 1.1 种毒来源
• 1.2 试验动物
• 1.3 培养基及主要化学试剂的配制
• 1.4 其它材料
• 2 试验方法
• 2.1 种毒处理
• 2.2 病毒在螯虾体内的增殖
• 2.3 螯虾鳃组织基因组提取
• 2.4 引物设计（检测用）
• 2.5 PCR反应体系和条件
• 2.6 PCR产物的凝胶电泳
• 2.7 病毒的分离纯化
• 2.8 电镜观察
• 2.9 病毒的结构蛋白SDS-PAGE分析
• 3 试验结果
• 3.1 螯虾接种后的临床症状
• 3.2 PCR检测结果
• 3.3 纯化病毒粒子的形态学观察
• 3.4 纯化病毒的SDS-PAGE分析
• 4 讨论
• 4.1 WSSV的增殖
• 4.2 WSSV的分离纯化
• 4.3 WSSV病毒粒子的形态观察和结构蛋白分析
• 第三篇 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因在大肠杆菌中的表达及纯化
• 1 基因克隆及表达策略
• 1.1 基因克隆策略
• 1.2 基因表达策略
• 2 试验材料
• 2.1 病毒
• 2.2 菌种和质粒
• 2.3 引物设计:
• 2.4 培养基及主要化学试剂的配制
• 2.5 其他试剂
• 3 试验方法
• 3.1 WSSV基因组提取
• 3.2 PCR反应体系及条件
• 3.3 DNA电泳
• 3.4 目的片段的割胶回收
• 3.5 DNA片段与T载体连接
• 3.6 感受态细胞的制备
• 3.7 连接产物转化
• 3.8 重组质粒的提取与鉴定
• 3.9 测序
• 3.10 重组克隆质粒和表达载体酶切
• 3.11 目的片段与表达载体连接
• 3.12 连接产物转化表达宿主菌
• 3.13 阳性表达子的筛选
• 3.14 阳性表达子的诱导表达
• 3.15 表达产物的SDS-PAGE检测
• 3.16 表达产物的Western blot分析
• 3.17 表达产物的纯化
• 4 试验结果
• 4.1 VP28基因的克隆
• 4.2 VP28核苷酸序列分析
• 4.3 表达产物的SDS-PAGE检测和产物的Western blot分析
• 4.4 表达产物的纯化
• 5 讨论
• 5.1 VP28基因克隆及分析
• 5.2 大肠杆菌表达系统
• 5.3 VP28基因在大肠杆菌中的表达及纯化
• 第四篇 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因在昆虫细胞中的表达
• 1 试验材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 引物设计
• 1.3 培养基及主要化学试剂的配制
• 1.4 其他试剂
• 2 试验方法
• 2.1 VP28基因克隆及重组质粒构建
• 2.2 重组转移载体质粒pFastBac-VP28的构建策略
• 2.3 重组杆状病毒构建及目的基因表达
• 3 试验结果
• 3.1 VP28基因的克隆
• 3.2 重组Bacmid-VP28感染Sf9细胞
• 3.3 表达产物的SDS-PAGE及Western blot分析
• 4 讨论
• 4.1 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
• 4.2 VP28基因在Sf9细胞中的表达
• 第五篇 高温对WSSV在螯虾体内增殖的影响
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物、病毒、菌种和质粒
• 1.2 其他材料
• 2 试验方法
• 2.1 WSSV感染浓度体内滴定
• 2.2 水温对WSSV口服感染螯虾的影响
• 2.3 高水温对WSSV感染螯虾的影响
• 2.4 高水温对WSSV增殖的影响
• 2.5 竞争性PCR内标的构建
• 2.6 竞争性PCR检测
• 2.7 数据分析
• 3 试验结果
• 3.1 病毒体内滴定
• 3.2 水温对WSSV感染螯虾的影响
• 3.3 高水温对WSSV感染螯虾的影响
• 4 讨论
• 4.1 温度对WSSV感染的影响
• 4.2 高温对WSSV增殖的影响
• 第六篇 重组VP28蛋白的抗病性比较
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物、纯化病毒液
• 1.2 重组VP28蛋白
• 1.3 其他材料
• 2 试验方法
• 2.1 重组VP28蛋白定量
• 2.2 注射用VP28蛋白处理
• 2.3 螯虾体内保护性试验
• 2.4 数据分析
• 3 试验结果
• 3.1 重组VP28蛋白浓度
• 3.2 螯虾体内保护性试验
• 4 讨论
• 第七篇 论文提示及今后需要进一步研究的问题
• 1 提示
• 2 今后需进一步研究的问题
• 参考文献
• 附录一 pUCm-T Vector
• 附录二 pET-30a（+） Vector
• TMHTA'>附录三 pFastBac^TMHTA
• 攻读博士学位期间发表的与学位论文相关的文章
• 致谢