桂花花瓣衰老过程中细胞程序性死亡特征与机制研究

论文摘要

桂花（Osmanthus.fragrans Lour.）是木犀科常绿花卉,起源与演化中心在我国,栽培历史悠久,为我国十大传统名花之一。桂花树姿优美,四季常绿,花开时香飘万里,集绿化、美化、香化于一体,观赏与实用兼备于一身。不仅广泛用作行道树、庭荫树、孤植树,成为很多城市的市花,而且也是著名的芳香源植物,广泛用于香料、制茶、食品、酿酒等方面,深受我国人民的喜爱。另外,桂花作为切花也有极大的开发潜力,但其花朵的寿命较短,这在很大程度上限制了桂花的观赏价值与经济价值。因此,研究花瓣的衰老机制和调控措施对开发家庭切花应用潜力与延长桂花在园林中的观赏期以及花香散发持续时期都有一定的理论和实践指导意义。本研究首先对桂花花瓣衰老过程特征进行了观测,并提出桂花单花开花至衰老的不同阶段划分标准,建立桂花花材外源药剂处理实验体系。从桂花开花至衰老不同阶段,采集树体上花瓣进行水分、膜脂过氧化程度（包括花瓣MDA含量、O2-（超氧阴离子自由基）产生速率以及SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）、APX（抗坏血酸过氧化物酶）、AsA（抗坏血酸）等抗氧化酶的活性与抗氧化物质含量）的检测、蛋白质含量与组分SDS—PAGE分析、花瓣细胞核DNA降解的TUNEL（原位末端标记法,Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick endlabeling）检测与琼脂糖凝胶电泳观察。另外还进行了花瓣组织切片的显微与超微结构的观察。并探讨了外源乙烯、Ca2+与活性氧对花瓣上述指标的影响。结果表明:1.衰老花瓣的细胞结构在花朵寿命结束时仍保持完整,维管束一直保持一定状态与功能,而表皮细胞出现明显凹陷。桂花花瓣在衰老后期可观察到细胞核凝缩、染色质凝集、边缘化等现象,凋亡促进剂喜树碱可加剧上述特征的出现。但通过琼脂糖凝胶电泳只观察到DNA发生轻微弥散状降解,未检测到以200bp及其整数倍递增的DNA片断“DNA ladders”这一PCD典型生化特征。2.桂花花瓣衰老PCD程序在盛花期可能已启动,此时花瓣还处于最佳观赏状态。花瓣内源活性氧的大爆发导致膜脂过氧化程度加剧与新的蛋白质表达可能为先导事件,而花瓣大量可溶性蛋白质的降解与核DNA断裂可能为后续或结果事件。在保护膜脂的抗氧化系统中,SOD与APX可能起主要作用。此外,树体上花脱落时花瓣蛋白质降解与DNA断裂程度还不剧烈。但可检测到衰老后期花瓣发生DNA断裂的细胞数量增多,上述发生核DNA断裂的细胞在花瓣组织中呈随机分布。3.本研究未检测到不同品种桂花花瓣衰老过程中内源乙烯的释放,但外源乙烯对不同品种的效应不同,多数桂花品种对乙烯不敏感。其中供试品种柳叶金桂对外源乙烯敏感,乙烯处理能明显促进花瓣失水,内源活性氧产生,膜脂过氧化程度加剧,但对抗氧化系统影响不大。乙烯促进新蛋白质的表达,并诱导了一条63.4KD特异性蛋白质条带,可能与基因调控表达相关。另外,乙烯具有显著促进桂花花瓣核DNA断裂的作用。4.Ca2+对桂花花瓣衰老PCD具有双重作用:低浓度的Ca2+具有一定延迟花瓣衰老的作用,但这一作用不能长期保持;而高浓度Ca2+则具有明显启动花瓣细胞PCD的作用。花瓣总Ca2+含量随着花瓣衰老程度加剧而升高,外源Ca2+处理能明显增加花瓣内源Ca2+含量,推测胞质外Ca2+能稳定膜结构延缓PCD的启动而细胞总Ca2+含量超过某一阀值激发胞质内Ca2+含量增加导致PCD启动。并且,Ca2+可能主要通过激活蛋白质水解酶与核酸酶,从而导致蛋白质大量降解与DNA断裂,使花瓣衰老PCD的进程加剧。5.外源活性氧（H2O2）处理能明显促进桂花花瓣衰老,而活性氧清除剂Vc（抗坏血酸）具有延缓衰老的作用。H2O2处理对花瓣SOD与APX活性影响不大,低浓度Ca2+处理对H2O2对膜的伤害具有一定的缓解作用。H2O2处理诱导了新蛋白质的提早合成,其中有三条36.8KD、23.9KD、23.7KD条带为H2O2特异性诱导,推测可能为PCD特异调控蛋白。低浓度Ca2+对H2O2处理的花瓣在处理早期具有延缓上述新条带出现的作用,但后期反而有加速蛋白质降解的作用,这与上一点结果一致。另外,外源活性氧处理具有促进DNA断裂的作用,但这一作用较为延后,Ca2+对H2O2促进DNA断裂有一定抑制作用。综上所述,对于桂花花瓣衰老,PCD程序在花朵开放至最大状态时已开始启动,膜脂过氧化程度加剧与新的蛋白质表达可能为先导事件,花瓣大量蛋白质的降解与核DNA断裂可能为后续事件。衰老花瓣细胞可观察到轻度核凝缩、染色质边缘化等典型特征。而花瓣核DNA在衰老后期尽管发生断裂,但呈弥散降解,未出现“DNAladders”这一PCD典型生化特征。像桂花这样的大型灌木花卉花瓣衰老PCD的研究,前人还很少涉足,主要集中于大众商业切花的研究。仅目前在日本樱花上的研究与桂花的研究结果类似,均是PCD典型生化特征不明显而且发生的时间较晚,这一点可能与众多草本花卉不同,暗示内部调控机制的不同。另外,对于PCD的关键调控因子,活性氧可能是桂花花瓣最主要的PCD调控与信号因子,Ca2+在桂花花瓣PCD过程中可能具有双重功能,而乙烯对多数桂花品种不起主要调控作用。对于同时综合研究三个PCD关键调控因子在花瓣衰老PCD过程中的作用机制,国内外还未见相关报道。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第1章 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 桂花研究进展
• 1.1.2 细胞程序性死亡研究进展
• 1.1.2.1 PCD典型特征的检测技术
• 1.1.2.2 动物细胞PCD的研究进展
• 1.1.2.3 植物细胞PCD研究进展
• 1.1.3 植物PCD的调控机制
• 1.1.3.1 植物PCD关键的调控与信号因子
• 1.1.3.2 植物PCD过程执行因子
• 1.1.4 观赏植物花瓣衰老PCD研究进展
• 1.1.4.1 花瓣衰老PCD典型特征研究
• 1.1.4.2 花瓣衰老PCD主要事件研究
• 1.1.4.3 花瓣衰老PCD的调控机制研究
• 1.1.4.4 花瓣衰老PCD的信号转导途径
• 1.1.4.5 花瓣衰老PCD的相关基因研究
• 1.2 本研究的目的与意义
• 1.3 本文的创新之处
• 第2章 桂花花瓣衰老研究中的采样阶段划分与花材处理体系研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 桂花花瓣衰老特征观察
• 2.1.2.2 桂花花材处理方式比较
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 桂花花朵的衰老特征研究与桂花开花至衰老过程的阶段划分
• 2.2.1.1 桂花花朵衰老特征观察结果
• 2.2.1.2 桂花单朵小花开花至衰老花朵特征变化
• 2.2.2 桂花花材处理方式比较
• 2.3 讨论与结论
• 2.3.1 桂花开花至衰老阶段划分
• 2.3.2 桂花花材处理方式确定
• 第3章 桂花开花至衰老过程中花瓣的细胞学变化与PCD典型特征研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 桂花花瓣石蜡切片的制作与观察
• 3.1.2.2 桂花花瓣扫描与透射电镜切片的制作与观察
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 桂花花瓣的基本解剖结构特点
• 3.2.2 桂花开花至衰老不同时期花瓣的显微结构变化
• 3.2.3 桂花花瓣的超微结构变化及典型PCD特征研究
• 3.2.3.1 桂花花瓣扫描电镜观测结果
• 3.2.3.2 桂花花瓣透射电镜观测及典型PCD解剖学特征观测
• 3.3 讨论与结论
• 3.3.1 桂花花瓣解剖结构与衰老的关系
• 3.3.2 桂花花瓣PCD典型特征研究
• 第4章 桂花开花至衰老过程中花瓣PCD事件研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 桂花花瓣鲜重、干重与含水量的测定
• 2^?含量测定'>4.1.2.2 桂花花瓣MDA与O₂^?含量测定
• 4.1.2.3 桂花花瓣SOD与POD活性的测定
• 4.1.2.4 桂花花瓣APX活性的测定
• 4.1.2.5 桂花花瓣AsA与DAsA含量的测定
• 4.1.2.6 桂花花瓣蛋白质含量的测定与SDS—PAGE电泳
• 4.1.2.7 桂花花瓣TUNEL检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 桂花花瓣鲜重、干重与含水量变化
• 2^?产生速率的变化'>4.2.2 桂花花瓣MDA含量与O₂^?产生速率的变化
• 4.2.3 桂花花瓣SOD与POD活性的变化
• 4.2.4 桂花花瓣APX活性、AsA含量与DAsA含量的变化
• 4.2.5 桂花花瓣可溶性蛋白质含量与SDS—PAGE电泳图谱的变化
• 4.2.6 花瓣细胞核DNA断裂TUNEL检测结果
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 桂花花瓣衰老PCD与水分营养代谢
• 4.3.2 桂花花瓣衰老PCD与膜脂过氧化
• 4.3.3 桂花花瓣衰老PCD与蛋白质降解
• 4.3.4 桂花花瓣衰老PCD与核DNA断裂
• 第5章 乙烯与桂花花瓣PCD的关系研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 桂花花瓣内源乙烯释放测定
• 5.1.2 乙烯利（ETP）与硫代硫酸银（STS）对不同桂花品种的处理
• 5.1.2.1 开花级数与瓶插寿命的观测
• 5.1.2.2 其它指标测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 桂花开花至衰老过程中内源乙烯释放测定结果
• 5.2.2 ETP与STS对不同品种桂花切花外观品质与瓶插寿命的影响
• 5.2.3 乙烯对桂花花瓣鲜重与含水量的影响
• 2^?含量的影响'>5.2.4 乙烯对桂花花瓣MDA与O₂^?含量的影响
• 5.2.5 乙烯对桂花花瓣SOD与APX活性的影响
• 5.2.6 乙烯对桂花花瓣蛋白质合成与降解的影响
• 5.2.7 乙烯对桂花花瓣细胞核DNA断裂的影响
• 5.3 讨论
• 5.3.1 桂花对乙烯的敏感性探讨
• 5.3.2 乙烯与敏感型桂花品种花瓣衰老PCD的关系
• 2+与桂花花瓣PCD的关系研究'>第6章 Ca²⁺与桂花花瓣PCD的关系研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 处理方法
• 6.1.2.2 测定指标
• 6.2 结果与分析
• 2+含量的变化'>6.2.1 桂花自然开花至衰老过程中花瓣Ca²⁺含量的变化
• 2处理对桂花切花开花级数与瓶插寿命的影响'>6.2.2 CaCl₂处理对桂花切花开花级数与瓶插寿命的影响
• 2+对桂花花瓣衰老PCD事件的影响'>6.2.3 Ca²⁺对桂花花瓣衰老PCD事件的影响
• 2处理对桂花花瓣内源总Ca²⁺含量的影响'>6.2.3.1 CaCl₂处理对桂花花瓣内源总Ca²⁺含量的影响
• 2+对桂花花瓣鲜重与含水量的影响'>6.2.3.2 Ca²⁺对桂花花瓣鲜重与含水量的影响
• 2+对桂花花瓣MDA与O₂^?含量的影响'>6.2.3.3 Ca²⁺对桂花花瓣MDA与O₂^?含量的影响
• 2+处理对桂花花瓣SOD活性的影响'>6.2.3.4 Ca²⁺处理对桂花花瓣SOD活性的影响
• 2+对桂花花瓣APX活性的影响'>6.2.3.5 Ca²⁺对桂花花瓣APX活性的影响
• 2+对桂花花瓣蛋白质合成与降解的影响'>6.2.3.6 Ca²⁺对桂花花瓣蛋白质合成与降解的影响
• 2+对桂花花瓣DNA断裂的影响'>6.2.3.7 Ca²⁺对桂花花瓣DNA断裂的影响
• 6.3 结论与讨论
• 第7章 活性氧与桂花花瓣PCD的关系研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.1.2.1 活性氧诱发剂与清除剂的筛选实验
• 2+与活性氧在桂花花瓣PCD过程中的互作关系研究'>7.1.2.2 Ca²⁺与活性氧在桂花花瓣PCD过程中的互作关系研究
• 7.1.2.3 活性氧与桂花花瓣PCD的关系研究
• 7.1.2.4 检测指标与方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 活性氧对桂花切花瓶插效应的影响
• 7.2.1.1 活性氧诱发剂与清除剂对桂花切花瓶插寿命的影响
• 2+互作对桂花切花瓶插寿命的影响'>7.2.1.2 活性氧与Ca²⁺互作对桂花切花瓶插寿命的影响
• 7.2.2 活性氧对桂花花瓣衰老PCD事件的影响
• 7.2.2.1 不同处理对桂花花瓣鲜重与含水量的影响
• 2^?含量的影响'>7.2.2.2 不同处理对桂花花瓣MDA与O₂^?含量的影响
• 7.2.2.3 不同处理对桂花花瓣SOD与APX活性的影响
• 7.2.2.4 不同处理对桂花花瓣蛋白质合成与降解的影响
• 7.2.2.5 不同处理对桂花花瓣DNA断裂的影响
• 7.3 结论与讨论
• 第8章 结论与总讨论
• 8.1 桂花花瓣衰老PCD典型特征研究
• 8.2 桂花花瓣衰老过程中PCD事件的启动时间、发生顺序以及各事件的重要性分析
• 2+、活性氧与桂花花瓣衰老PCD的关系及其重要性分析'>8.3 乙烯、Ca²⁺、活性氧与桂花花瓣衰老PCD的关系及其重要性分析
• 8.4 本研究存在的问题与展望
• 参考文献
• 图版:桂花花瓣蛋白质SDS-PAGE图谱
• 附录
• 论文发表情况
• 参加国际国内学术会议情况
• 致谢