猪血多肽的制备及其生物活性研究

论文摘要

我国每年屠宰生猪近5亿头，占世界生猪屠宰总量的45％，猪血资源十分丰富，但目前除少量用于制作血豆腐、血肠或直接食用外，基本未得到开发利用，不仅浪费了资源，同时又严重污染了环境。本课题以新鲜猪血为原料，利用自筛的A32菌株进行发酵，获得低分子量的猪血多肽。同时研究了猪血多肽的抗氧化、降血脂、增强免疫功能等生物活性，主要结果如下： 1．发酵猪血优良菌株的分离筛选利用平板划线法，从农村个体屠宰场土壤中分离获得了菌株A32，该菌株在以猪血为惟一氮源的培养基上生长旺盛且蛋白酶活力强。利用该菌株发酵猪血粉，使猪血粉的蛋白质含量下降了28.7％，氨基酸态氮含量上升了4.20倍，可溶性蛋白质含量上升了60％，说明A32菌株是发酵猪血的优良菌株。 2．菌株鉴定生理生化鉴定：革兰氏染色后为阳性，有芽孢，无伴孢晶体，该菌在细胞壁染色后菌体内呈浅色，外围有明显的紫色圈，初步鉴定为产芽孢细菌。分子生物学鉴定：将A32菌株16s rDNA序列提交GenBank进行Blast比对，经过同源序列比较，最终鉴定A32为枯草芽孢杆菌。 3．A32菌株产蛋白酶条件研究通过单因素试验以及正交试验确定了A32优化培养基配方：豆粕粉2％、玉米粉3％、0.4mmol／L Mn2+、Na2HPO4·12H2O 0.4％、KH2PO40.03％、Na2CO3 0.01％、pH 7.2；同时还研究了培养时间、摇瓶转速、接种量、温度对产酶的影响，试验结果表明培养时间48h、接种量3％、温度30℃组合有利于蛋白酶的产生，摇瓶转速190r／min较为理想。 4．A32菌株发酵猪血条件的优化在探讨了发酵时间、温度、接种量、起始pH值，装料量等单因素对猪血发酵影响的基础上，进行二次回归旋转组合设计，以接种量、发酵温度、发酵时间三个因素为自变量，以水解度DH为响应值，应用响应面分析法研究了发酵时间、发酵温度、接种量对肽产量的影响。试验结果表明，发酵温度与时间及接种量对猪血肽的生成有显著影响，发酵条件优化结果为接种量为4％、发酵温度为31℃、发酵时间为60h，根据数学模型预测值为37.97％，试验实际值为37.956％。 5．猪血多肽的分离及其成分分析

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第一章文献综述

1 前言

2 外源性生物活性肽的研究进展

2.1 生物活性肽的定义

2.2 外源性生物活性肽的功能

2.3 外源性生物活性肽的制备方法研究

3 猪血的研究与利用现状

3.1 猪血的化学成分

3.2 猪血的开发利用

4 本课题的目的意义、研究内容及技术路线

4.1 目的意义

4.2 研究内容

4.3 技术路线

参考文献

第二章发酵猪血优良菌株的筛选

1 材料与方法

1.1 培养基

1.2 主要仪器

1.3 对照菌株

1.4 主要试剂

1.5 试验方法

2 结果与分析

2.1 菌种的分离

2.2 菌种的初筛

2.3 菌株产蛋白酶活力

2.4 发酵猪血粉品质

3 结论

参考文献

第三章发酵猪血优良菌株A32的鉴定

1 材料与方法

1.1 菌种来源

1.2 主要实验仪器

1.3 主要试剂

1.4 培养基

1.5 细菌形态特征鉴定

1.6 16S rDNA的鉴定

2 结果与分析

2.1 细菌形态特征鉴定

2.2 PCR扩增结果

2.3 序列分析

3 结论

参考文献

32菌株产蛋白酶条件的优化'>第四章枯草芽孢杆菌A₃₂菌株产蛋白酶条件的优化

1 材料与方法

1.1 菌种

1.2 培养基

1.3 主要仪器

1.4 主要试剂

1.5 实验方法

2 结果与分析

32产酶活力的影响'>2.1 不同氮源对枯草芽孢杆菌A₃₂产酶活力的影响

2.2 不同碳源对酶活力的影响

2.3 不同金属离子对酶活力的影响

2.4 接种量对酶活力的影响

2.5 起始pH值对酶活力的影响

2.6 摇瓶转速对产酶的影响

2.7 温度对产酶的影响

2.8 培养时间对产酶的影响

2.9 培养时间、温度、接种量正交试验结果

3 讨论

32产酶活力的影响'>3.1 关于不同氮源对A₃₂产酶活力的影响

3.2 关于不同碳源对酶活力的影响

3.3 关于不同金属离子对酶活力的影响

3.4 关于接种量对酶活力的影响

3.5 关于起始pH值对酶活力的影响

3.6 关于温度对产酶的影响

4 结论

参考文献

32菌株发酵猪血条件的优化'>第五章枯草芽孢杆菌A₃₂菌株发酵猪血条件的优化

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.2 主要仪器与设备

1.3 方法

2 结果与讨论

32发酵猪血的影响'>2.1 接种量对枯草芽孢杆菌A₃₂发酵猪血的影响

32发酵猪血水解度的影响'>2.2 起始pH值对枯草芽孢杆菌A₃₂发酵猪血水解度的影响

32发酵猪血的影响'>2.3 通气量对枯草芽孢杆菌A₃₂发酵猪血的影响

32发酵猪血的影响'>2.4 温度对枯草芽孢杆菌A₃₂发酵猪血的影响

32发酵猪血的影响'>2.5 发酵时间对枯草芽孢杆菌A₃₂发酵猪血的影响

2.6 回归方程的建立与显著性分析

2.7 显著交互作用对发酵猪血蛋白水解度的影响

2.8 利用回归方程对发酵条件的优化

3 结论

参考文献

第六章猪血多肽的分离及其组分分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要仪器

1.3 试验方法

2 结果与分析

2.1 猪血粉与猪血多肽的得率及其主要组分比较

2.2 猪血发酵液超滤前后组分的变化

2.3 超滤膜膜通量随时间的变化

2.4 超滤膜膜通量随压力的变化

2.5 猪血多肽分子量分布

2.6 猪血多肽的中红外光谱

2.7 猪血多肽与猪血粉游离氨基酸含量比较

2.8 猪血多肽与猪血粉氨基酸组成比较

3 讨论

3.1 关于膜分离技术在猪血多肽分离中的应用

3.2 关于猪血多肽的组成成分

4 结论

参考文献

第七章猪血多肽安全性评价研究

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验动物及饲养

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

1.5 急性毒性试验

1.6 长期毒性实验

1.7 数据统计处理

2 结果与分析

2.1 猪血多肽的急性毒性

2.2 猪血多肽的长期毒性试验

3 讨论

3.1 关于猪血多肽的急性毒性试验

3.2 关于猪血多肽的长期毒性试验

4 结论

参考文献

第八章猪血多肽抗氧化性研究

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 试验动物

1.4 数据处理

1.5 方法

2 结果与分析

2.1 猪血多肽的还原能力

2.2 猪血多肽清除自由基的能力

2.3 猪血多肽对肝中毒小鼠抗氧化酶活力的影响

3 讨论

3.1 猪血多肽的体外抗氧化能力

3.2 猪血多肽的体内抗氧化能力研究

4 结论

参考文献

第九章猪血多肽增强免疫功能活性研究

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要药品及试剂

1.3 主要的仪器和设备

1.4 试验方法

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 猪血多肽对小鼠脾指数、胸腺指数的影响

2.2 猪血多肽对DNFB致小鼠DTH反应的影响

2.3 猪血多肽对小鼠碳粒廓清实验的影响

2.4 猪血多肽对小鼠腹腔巨噬细胞（PM）吞噬功能的影响

3 讨论

3.1 关于猪血多肽对小鼠免疫器官的影响

3.2 关于猪血多肽对DNFB致小鼠DTH反应的影响

3.3 关于猪血多肽对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

4 结论

参考文献

第十章猪血多肽辅助降血脂功能研究

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要试剂和药品

1.3 主要仪器和设备

1.4 试验方法

2 结果与分析

2.1 高血脂模型的建立

2.2 猪血多肽对大鼠血清TG浓度的影响

2.3 猪血多肽对大鼠血清TC浓度的影响

2.4 猪血多肽对大鼠血清HDL-C浓度的影响

2.5 猪血多肽对大鼠动脉硬化指数的影响

3 讨论

3.1 关于高血脂动物模型的建立

3.2 关于猪血多肽对高血脂大鼠TG、TC、HDL-C的影响

4 结论

参考文献

第十一章结论、创新点及下一步工作打算

1 结论

2 创新点

3 延续性研究计划

作者简介

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢

附录 A32测序报告单

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