组蛋白乙酰转移酶p300对人PTTG基因表达调控的影响及其分子机制研究

2020-12-07阅读(489)

论文摘要

组蛋白的翻译后修饰所引起的染色质结构的重塑在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用。其中研究得最深入的是由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）催化的乙酰化反应。这两种酶通过对核心组蛋白尾部赖氨酸残基进行可逆的乙酰化修饰来调控转录的起始，并由此介导基因的激活或抑制。转录辅激活子p300／CBP和P／CAF是具有组蛋白乙酰转移酶活性的蛋白，能通过多种机制参与许多基因的转录调控过程。本论文旨在确定可逆的组蛋白乙酰化修饰是否参与hPTTG基因的转录调控，并试图探讨其分子机制。通过一系列瞬时转染和相对荧光素酶活性分析以及RT-PCR和Western Blotting实验，我们发现组蛋白乙酰转移酶p300／CBP不仅能促进hPTTG启动子的活性，而且能提高hPTTG内源mRNA和蛋白的表达水平。E1A蛋白能抑制p300对hPTTG报告基因转录激活的促进作用，这也间接地证明了p300／CBP能促进hPTTG基因的表达。我们的结果还表明p300／CBP可分别与转录因子NF-YA／YB协同地促进hPTTG报告基因的转录活性。此外，我们通过采用HAT区缺失突变的p300表达质粒的转染实验，证明了p300／CBP的组蛋白乙酰转移酶活性在hPTTG基因转录调控过程中发挥重要作用。通过染色质免疫沉淀实验（ChIP），我们发现p300／CBP能够提高hPTTG内部启动子处组蛋白H3的乙酰化水平。另外，我们的结果表明另一种组蛋白乙酰转移酶P／CAF也能促进hPTTG报告基因的表达。在它们促进hPTTG报告基因表达的过程中，p300／CBP和P／CAF的HAT活性都非常重要。另外，我们还验证了六种人组蛋白去乙酰化酶（HDAC1～6）对hPTTG报告基因表达水平的影响。结果表明，HDAC3和HDAC6能抑制hPTTG报告基因的活性。本论文的结果首次揭示了组蛋白可逆的乙酰化修饰参与hPTTG基因的转录调控，并对其分子机制进行了初步的探讨，为深入研究hPTTG基因转录调控机制和hPTTG相关疾病的研究奠定了基础。

论文目录

中文摘要

英文摘要

目录

第一部分研究背景

一、组蛋白乙酰化修饰与真核生物基因的转录调控

（一）真核生物的染色质结构与转录调控的关系

（二）组蛋白乙酰化修饰与转录调控

（三）组蛋白乙酰转移酶p300/CBP复合物的研究进展

（四）组蛋白乙酰化修饰与真核生物转录调控的关系

二、组蛋白去乙酰化修饰与真核生物基因的转录调控

（一）组蛋白去乙酰化酶的分类

（二）组蛋白去乙酰化酶的生物学功能

（三） HDAC抑制剂

三、人PTTG基因及其转录调控机制的研究进展

（一） PTTG基因的发现

（二） hPTTG基因的定位

（三） hPTTG基因结构及表达

（四） PTTG的作用机制

（五） PTTG与垂体肿瘤

（六） PTTG的研究展望

四、本论文研究的内容和意义

（一）立题依据

（二）本文的研究内容和意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

（一）质粒

（二） hPTTG启动子报告基因质粒的构建

（三）蛋白质和抗体

（四）哺乳动物细胞系

（五）试剂

二、实验方法

Ⅰ.分子生物学实验方法

（一）分子克隆

（二） DNA的琼脂糖凝胶电泳

（三）质粒大量制备的方法

（四）哺乳动物细胞总RNA的提取和反转录

（五）逆转录

（六） PCR和荧光实时定量realtime PCR

（七）染色质免疫沉淀实验

（八） RNA干涉

（九）哺乳动物细胞（HeLa）的基因组DNA提取

Ⅱ.细胞生物学实验方法

（一）哺乳动物细胞系的培养

（二）真核生物细胞的瞬时转染和荧光素酶报告基因检测

（三）蛋白质的Western Blotting分析

Ⅲ.统计分析

第三部分实验结果与分析

一、hPTTG报告基因质粒的构建及鉴定

二、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP在hPTTG转录调控中的作用

（一）腺病毒癌蛋白E1A抑制了p300介导的hPTTG启动子活性

（二） p300/CBP参与了hPTTG的转录激活

（三） p300参与hPTTG转录激活的机制

三、组蛋白乙酰转移酶p/CAF在hPTTG转录调控中的作用

四、组蛋白去乙酰化酶在hPTTG转录调控中的作用

第四部分讨论

一、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP、p/CAF和组蛋白去乙酰化酶HDAC3及HDAC6都参与了hPTTG的转录调控

二、p300通过NF-YA/YB招募到hPTTG启动子区域

三、组蛋白乙酰转移酶p300参与hPTTG基因表达调控的分子机制

（一）组蛋白乙酰转移酶p300的HAT活性在hPTTG基因表达调控中起重要作用

（二） p300通过乙酰化转录因子从而促进hPTTG基因的转录

四、组蛋白可逆的乙酰化修饰参与了hPTTG基因的转录调控过程

五、hPTTG基因表达调控的简单模型

主要结论和创新点

参考文献

附录

致谢

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