南方红豆杉（Taxus chinensis var.mairei）苯丙氨酸CoA酰基转移酶（BAPT）基因cDNA的克隆及原核表达

论文摘要

紫杉醇是一种四环二萜酰胺类化合物,1992底被美国FDA批准作为抗癌药物上市。它的作用机理在于能促进微管聚合抑制降解,从而抑制细胞有丝分裂。它广泛存在于红豆杉属植物中,但是红豆杉生长缓慢且紫杉醇含量低,因此运用生物化学和基因工程手段对紫杉醇生物合成途径、合成过程中关键酶及其编码基因的研究成为增加红豆杉中紫杉醇产量的一种新途径。 本研究根据已发表的东北红豆杉苯丙氨酸CoA酰基转移酶（BAPT）的cDNA序列设计引物,用RT-PCR方法克隆到编码南方红豆杉苯丙氨酸CoA酰基转移酶的cDNA全长,经序列分析该cDNA全长为1338bp,与已报道的该酶基因cDNA相比,其核苷酸同源率为97.76%。 我们将此cDNA按正确的读码框架克隆至原核表达载体pET28b（+）中,即pET-BAPT,转化E.coliBL21（DE3）,重组BAPT实现高效表达,主要以包涵体的形式存在,改变和优化诱导条件未能使目的蛋白得到可溶性表达。采用SDS-PAGE凝胶回收法对重组蛋白进行纯化,以此为抗原免疫大白兔,制备了该蛋白的多克隆抗血清,抗体效价为1:105,为通过Western-Blot检测转BAPT基因红豆杉细胞中该酶的表达情况提供了物质基础。 由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性,通过复性才能使蛋自形成正确的分子内二硫键,形成正确的构象,从而具有生物学活性,因此重组蛋白的复性特别必要。我们对包涵体中的重组BAPT进行了体外变复性研究,对其进行了提取、洗涤、溶解、纯化、复性一系列处理,通过酶学分析,未能恢复重组BAPT的活性。影响表达蛋白复性的因素很多,而且许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的,且没有普遍性,因此本实验中重组BAPT的复性及活性分析还需要进一步探索和研究。

论文目录

• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 紫杉醇研究背景及现状
• 1.1 红豆杉及紫杉醇概况
• 1.2 紫杉醇研究进展
• 1.3 紫杉醇合成途径及关键酶的分子生物学研究
• 2 目的基因的分离克隆技术
• 2.1 基因芯片技术
• 2.2 基因文库技术
• 2.3 功能蛋白组技术
• 2.4 mRNA差异显示技术
• 2.5 图位克隆技术
• 2.6 酵母双杂交技术
• 2.7 生物信息学技术
• 2.8 PCR技术
• 3 外源基因在原核系统中的表达与调控
• 3.1 外源基因在大肠杆菌中表达的优化
• 3.2 包涵体的形成及纯化
• 3.3 包涵体的去折叠与复性研究
• 3.4 重组蛋白的体外复性研究
• 研究背景
• 第一章 南方红豆杉苯丙氨酸CoA酰基转移酶基因的克隆
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种及质粒
• 1.3 试剂
• 2 方法
• 2.1 红豆杉细胞总RNA的提取与鉴定
• 2.2 反转录与聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.3 RT-PCR产物的电泳鉴定及凝胶产物回收
• 2.4 外源基因与T-载体的连接
• 2法）'>2.5 感受态大肠杆菌细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.6 重组质粒对E.coliDH5α的转化（热激法）
• 2.7 质粒DNA的提取
• 2.8 重组质粒的酶切鉴定
• 2.9 测序及同源性比较
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA纯度及完整度的鉴定
• 3.2 RT-PCR反应
• 3.3 PCR产物与T-载体的连接、筛选及鉴定
• 3.4 BAPT基因的测序分析
• 4 讨论
• 第二章 重组BAPT蛋白在原核系统中的表达
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 3）表达系统的构建'>2.1 原核表达系统pET-BAPT/BL21（DE₃）表达系统的构建
• 2.2 重组蛋白的诱导表达
• 2.3 SDS-PAGE
• 2.4 可溶性重组蛋白表达的优化
• 2.5 重组BAPT蛋白的纯化
• 2.6 兔抗BAPT血清的制备
• 3 结果与分析
• 3）的构建'>3.1 pET-BAPT／BL21（DE₃）的构建
• 3）总蛋白的诱导表达'>3.2 pET-BAPT／BL21（DE₃）总蛋白的诱导表达
• 3.3 重组BAPT在大肠杆菌中的分布
• 3.4 重组BAPT的纯化
• 3.5 多克隆抗血清的制备
• 4 讨论
• 第三章 重组BAPT的体外活性分析
• 1 材料
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 可溶性重组蛋白的诱导表达
• 2.2 包涵体的去折叠
• 2.3 包涵体蛋白的亲和层析纯化
• 2.4 包涵体蛋白的复性（透析复性法）
• 2.5 复性BAPT的检测
• 3 结果
• 3.1 改变诱导条件和更换原核表达系统未能实现重组蛋白的可溶性表达
• 3.2 包涵体蛋白的复性
• 3.3 通过体外活性分析表明以上处理的重组BAPT未能表现出酶活性
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历