论文摘要
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）属于葡萄球菌属,革兰氏染色阳性,广泛分布于自然界。它可以产生多种外毒素和酶,致病性强,能够引起人和多种动物的感染,表现为皮肤、软组织感染也可导致败血症、心内膜炎、肺炎、脑膜炎等；此外尚可引起尿路感染、骨髓炎、关节炎、肠炎等。近年来美国疾控中心报告,由S. aureus引起的感染仅次于大肠杆菌占第二位（王凤玲等,2007）。在美国由S. aureus肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%,加拿大则占到45%,而我国每年发生的此类食物中毒事件也非常多。S. aureus也是引起奶牛乳腺炎的主要病原体之一,能够造成奶牛业巨大的经济损失。要成功地维持感染,几乎所有的细菌、真菌和原生动物都需要铁。细菌一般通过两种途径从外界获得铁,其一是通过摄取外源宿主细胞本身的含铁蛋白来满足自身需要,如血红蛋白、转铁蛋白等；其二是通过其自身合成的对铁离子有很高亲和性的低分子量铁载体来摄取铁。金黄色葡萄球菌也不例外,它们除了可以利用Isd （Iron-regulated surface determinants,铁调控表面决定簇）系统运输血红蛋白中的铁外,还拥有许多铁载体运输通道——如ABC transporter:包括分别由sirABC、sstABC、fhuCBG操纵子编码的转运系统。在sirABC操纵子中sirB和sirC编码的蛋白SirB和SirC位于细胞质膜跨膜区,而SirA是一种脂蛋白,位于细胞质膜外部能够捕获结合了铁的铁载体。本试验拟以sirABC操纵子编码的SirA蛋白与铁载体的结合为研究对象,通过PCR扩增出S. aureus基因组DNA中sirA基因,对该基因片段进行回收,将其连接到pColdTMF冷冻表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过IPTG诱导表达SirA-TF重组蛋白,采用蛋白纯化试剂盒对其进行纯化后测定重组蛋白浓度,免疫ICR小鼠制备SirA-TF重组蛋白多抗血清,应用间接ELISA方法测定免疫鼠血清抗体效价；用Western Blot检测含不同铁离子浓度培养条件下SirA蛋白的表达情况：分别用纯化的SirA蛋白、灭活的S. aureus菌体和无菌PBS溶液免疫小鼠,共三次免疫,在第三免7天后,分别用107=108、109CFU的活金葡菌进行小鼠鼻腔定植,定植七天后处死小鼠,剪下鼻腔组织进行鼻腔活菌总数测定。设计了试验探讨SirA多抗血清对S. aureus生长的影响和sirA在S. aureus致病过程中的作用。实验结果表明,成功扩增出sirA基因并将其连到表达载体pColdTMF中。SDS-PAGE结果表明重组质粒pColdTMF-sirA能够在E.coli BL21（DE3）中成功诱导利高效表达,且表达的重组蛋白是可溶性的。用重组蛋白免疫小鼠后制备的多抗血清抗体水平在加强免疫第二周达到1：64000；Western Blot检测表明,当金黄色葡萄菌在铁限制性培养条件下（大豆胰蛋白胨肉汤+600μM2’2-联吡啶）SirA蛋白量表达比在富铁培养下培养（大豆胰蛋白胨肉汤+50μMFeCl3）要高。鼻腔定植试验结果表明,小鼠在三免后7天,SirA蛋白免疫组（2283.33±411.86）对S. aureus的粘附阻断能力优于灭活S. aureus免疫组（4420.00±1408.97）（P<0.05）,并且显著高于PBS对照组（10203.33±1296.93）（P<0.01）；在第十四天,SirA蛋白免疫组（610.00±105.35）对S. aureus的粘附阻断能力优于PBS对照组（1683.33±367.46）（P<0.01）。抗体抑制试验表明,在缺铁条件下不同稀释的SirA多抗能够有效的降低S. aureus的生长,而在富铁条件下此种作用效果不如在缺铁培养下明显。综上所述,sirA基因在pColdTM TF冷冻表达载体中能够大量表达可溶性重组蛋白,且表达的重组SirA蛋白具有较好的免疫原性及免疫保护作用,为将来成功利用有效抗体治疗S. aureus感染提供了理论依据和技术支撑。