奉节脐橙果皮褐变生理及相关基因的分离研究

论文摘要

奉节脐橙（Citrus sinensis Osbeck）是一种优良的甜橙鲜食品种,在国内外市场享有较高声誉,是重庆市柑橘出口中唯一具有较强竞争优势的品种。但奉节脐橙果皮褐变发生较严重,主要症状为油胞破裂下陷、形成褐斑,极大地影响了果实的外观质量和商品价值。目前对脐橙果皮褐变的发生机制尚未进行深入研究,缺乏相应的控制措施,这已成为目前脐橙商品生产发展的关键制约因素。因此迫切需要开展果皮褐变的生理及分子机制研究。本研究以‘奉园72-1’脐橙为材料,果实采后分别采用常温（15℃）贮藏（对照）、低温（5℃）贮藏、打蜡或机械损伤后常温保藏,贮藏10周,每周测定一次生理指标。果皮褐变率统计结果显示,打蜡和机械损伤能加速果皮褐变的发生,5℃低温贮藏可以减少果皮褐变。对过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性研究发现,果皮褐变最严重的损伤果POD和PPO活性较高;打蜡促进PPO活性上升,而低温能有效抑制PPO活性。对苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性研究发现,PAL活性与果皮褐变率之间高度相关,损伤处理PAL活性最高。通过半定量RT-PCR方法研究pal基因在机械损伤和果皮褐变过程中的作用,发现损伤能增强pal2基因表达,且褐变果中pal2的表达明显强于未褐变果;pal6基因的表达模式与pal2相似,即在损伤果和褐变果中均表达增加,但pal6基因的表达水平明显低于pal2。因此我们认为PAL活性及pal基因表达与脐橙果皮褐变之间具有密切关系,在果实受到损伤和果皮褐变过程中,pal2基因对PAL酶活性的影响强于pal6基因。在第二次生理落果结束后进行叶面喷钙结合单果套袋处理可显著降低果实采后果皮褐变的发生,提高果实外观质量和商品性。综合以上研究结果发现:田间喷钙、套袋处理后适期采收,在采后处理及贮运中尽量减少机械损伤,采用适宜低温冷藏可有效减轻脐橙果皮褐变的发生。为了探明脐橙果皮褐变的分子机制,分别以褐变与未褐变的果皮mRNA作为检测方和驱动方,利用抑制差减杂交（SSH）技术,构建了脐橙果皮褐变正向差减cDNA文库。SSH文库中阳性克隆92个,阳性克隆比例为70%,重组子插入片段大小主要分布在150bp-600bp之间。随机挑取部分阳性克隆测序,测序结果利用NCBI的BLASTn和BLASTx在线软件进行序列相似性分析。在50个已经测序的克隆中单一克隆为28个,其中有22个在GenBank中具有同源序列,占单一克隆数的78.6%,另有6个未找到同源序列,可能代表了新基因。同源基因中包含了与物质代谢、成熟衰老以及胁迫病害相关的蛋白质,说明柑橘果皮褐变的发生是一

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 差异表达基因的分离策略
• 1.1.1 差示筛选
• 1.1.2 扣除杂交
• 1.1.3 mRNA 差异显示技术
• 1.1.4 RNA 指纹图谱技术
• 1.1.5 代表性差异分析
• 1.1.6 抑制差减杂交技术
• 1.1.7 微阵列（microarray）技术
• 1.2 柑橘果皮生理性病变研究进展
• 1.2.1 冷害引起的果皮病变
• 1.2.2 褐斑病
• 1.2.3 油斑病
• 1.2.4 果斑
• 1.3 课题的提出和研究意义
• 1.4 实验设计
• 1.4.1 主要研究内容
• 1.4.2 果皮褐变相关基因研究的技术路线
• 1.4.3 项目的特色与创新
• 2 奉节脐橙果皮褐变生理及调控技术研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料和果实处理
• 2.1.2 实验器材及仪器
• 2.1.3 溶液配制
• 2.1.4 测定项目和方法
• 2.1.5 果皮RNA 提取及cDNA 合成
• 2.1.6 半定量PCR 分析pal 基因表达
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 奉节脐橙果皮褐变的生理学研究
• 2.2.2 pal 基因的分离及表达研究
• 2.2.3 奉节脐橙果皮褐变的调控技术研究
• 2.3 小结与讨论
• 3 脐橙果皮褐变差减文库的构建与初步分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 果皮mRNA 的分离纯化
• 3.2.2 接头连接效率检测
• 3.2.3 差减效率鉴定
• 3.2.4 插入片段的大小鉴定
• 3.2.5 测序及序列分析
• 3.2.6 基因差异表达的半定量PCR 检测
• 3.3 讨论
• 4 脐橙果皮褐变相关基因的全长克隆和表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 果实材料与处理
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 RACE PCR 扩增
• 4.1.4 序列的生物信息学分析
• 4.1.5 果皮褐变相关基因的表达分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 3’和5’-RACE 结果
• 4.2.2 CsEXP 的生物信息学分析
• 4.2.3 CsSPR 的生物信息学分析
• 4.2.4 CsCAB 的生物信息学分析
• 4.2.5 Northern blot 分析
• 4.3 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录