厄贝沙坦预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用的研究

论文摘要

厄贝沙坦预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用的研究缺血性卒中的发病率和致死致残率较高，然而卒中后有效的治疗手段有限。目前公认的有效方法是溶栓治疗，但受溶栓时间窗和治疗条件所限，仅2％-5％的患者能进行该项治疗；同时溶栓治疗虽可建立缺血区血流再灌注，但不能解决缺血引起的脑组织再灌注损伤。因此，要减少脑血管病的危害，目前仍贵在预防为主；其次，强烈需求能对缺血损伤多个环节进行干预的神经保护治疗。脑组织存在独立而完善的局部肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS），血管紧张素Ⅱ（angiotenainⅡ，AngⅡ）是脑内RAS的主要活性肽，其作用主要是通过1型AngⅡ受体（angiotensinⅡtype 1 receptor,AT1R）和2型AngⅡ受体（angiotensinⅡtype 2 receptor，AT2R）介导而实现。一些研究表明：局部AngⅡ和其受体可能参与启动和调节缺血性脑损伤的病理生理过程，动物实验研究发现外周或脑室内应用AT1R拮抗剂可预防自发性高血压大鼠卒中的发生，减轻高血压和非高血压大鼠脑缺血后的神经损害。近期一些大型临床试验如Life、Access和Jikei Heart研究进一步给予确证上述实验性研究结果。实验性和临床研究表明AT1R拮抗剂的神经保护益处不能完全通过血压控制的差异来解释，提示AT1R拮抗剂对卒中的防治存在着降压以外的机制。然而，目前对AngⅡ与其受体在脑内的生理、病理机制还所知甚少，AT1R拮抗剂干预对缺血性脑损伤保护作用的内在分子机制仍不十分清楚。因此，本研究着重从脑缺血诱导的细胞凋亡、微血管和神经再生角度，探讨AT1R拮抗剂干预对缺血性脑损伤的神经保护机制。本课题包括以下三个部分工作：第一章：局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑内RAS变化及厄贝沙坦干预的影响目的研究局灶性脑缺血大鼠脑内肾素-血管紧张素的变化，探讨厄贝沙坦干预的影响及其脑保护作用。方法将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血组、厄贝沙坦预处理组[厄贝沙坦组,30mg／（kg．d）]连续灌胃3周。用线栓法制作右侧大脑中动脉缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）模型，TCC染色法测定梗死体积，逆转录-聚合酶链反应方法测定脑和外周血白细胞AT1RmRNA和AT2RmRNA表达，放免法测定脑组织和外周血AngⅡ水平、肾素活性。结果（1）与缺血组比较，厄贝沙坦组能显著性改善神经功能评分，减少梗死体积。（2）再灌注后24h和72h，缺血组大鼠的缺血侧和对侧皮质、下丘脑、脑干及外周血白细胞AT1R mRNA表达和AT2R mRNA表达均显著性高于假手术组（均P<0．01）；而厄贝沙坦组缺血后各时间点上述部位AT1R mRNA表达明显低于缺血组（均P<0．01），AT2R mRNA表达高于缺血组（均P<0．01）。（3）在IR后24h和72h，缺血组大鼠脑组织和外周血AngⅡ水平、外周血肾素活性均显著性增高；厄贝沙坦组大鼠脑组织、外周血AngⅡ和肾素活性与缺血组比较无显著性差异。结论脑缺血大鼠脑内AngⅡ、AT1RmRNA、AT2RmRNA表达增高，厄贝沙坦预处理对脑缺血的神经保护作用可能与拮抗AT1R、抑制AT1RmRNA表达、上调AT2RmRNA表达有关。第二章：厄贝沙坦预处理对脑缺血大鼠神经细胞凋亡及其调控分子的影晌目的检测厄贝沙坦预处理后脑缺血大鼠脑内CleavedCaspase-3、BDNF、VEGF蛋白和bcl-2／bax mRNA、Bcl-2／Bax及p-CREB／CREB比值的变化，探讨AT1R拮抗剂预处理对脑缺血诱导的凋亡及其调控分子的影响。方法雄性SD大鼠被随机分为假手术组、厄贝沙坦假手术组、缺血组、厄贝沙坦干预缺血组。厄贝沙坦干预假手术组和厄贝沙坦干预缺血组予厄贝沙坦30mg／（kg．d）连续灌胃3周。线栓法制作右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。缺血再灌注24h、72h和7d处死动物，TUNEL法观察脑缺血梗死灶周围神经细胞凋亡的变化，RT-PCR方法测定梗死灶周围脑组织bcl-2 mRNA和bax mRNA表达，Western blot方法测定梗死灶周围脑组织Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、BDNF、VEGF，CREB and p-CREB蛋白水平。结果脑缺血后凋亡神经细胞（TUNEL+细胞）主要见于梗死灶周围脑组织。与假手术组相比，缺血后24h～7d，缺血组TUNEL+细胞数目和促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3水平显著增加（均P<0．01），而bcl-2／bax mRNA比值在缺血后24h和72h显著降低（P<0．01，P<0．05）；同时缺血也诱导抗凋亡蛋白BDNF、VEGF及p-CREB／CREB比值水平在缺血后24h明显增加；但厄贝沙坦干预假手术组的TUNEL+细胞和上述凋亡相关蛋白与假手术组比较无显著性变化。与缺血组比较，在各观察时间点，厄贝沙坦预处理能显著抑制缺血诱导的神经细胞凋亡；下调缺血后24h的活性caspase-3水平，同时进一步上调缺血后24h抗凋亡蛋白BDNF、VEGF、p-CREB／CREB及bcl-2／bax mRNA比值水平，Bcl-2／Bax比值变化与其bcl-2／bax mRNA变化一致。结论厄贝沙坦预处理可显著抑制脑缺血诱导的神经细胞凋亡，其机制可能与通过AT2 R通路下调促凋亡分子活性caspase-3水平，同时上调抗凋亡蛋白BDNF、VEGF、p-CREB和Bcl-2／Bax比值水平有关。第三章：厄贝沙坦预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠脑血管和神经再生的影响目的探讨厄贝沙坦预先应用对脑缺血／再灌注损伤大鼠脑血管和神经再生的影响。方法雄性SD大鼠随机分成假手术组、缺血组和厄贝沙坦组。厄贝沙坦组大鼠每日给予厄贝沙坦30mg／（kg．d）（6mg／ml）灌胃，缺血组与假手术组给予等量生理盐水。线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。采用BrdU免疫组化法观察缺血后3d、7d、14d、21d海马齿状回（dentate gyrus，DG）神经干细胞的增殖数；CD31免疫组化法观察缺血后3d缺血灶周围新生微血管数。结果（1）正常成年SD大鼠海马DG区存在少量BrdU+细胞。脑缺血组再灌注3d双侧海马DG区BrdU+细胞的数量开始增多，7d达到高峰，14 d后显著下降，21d接近正常水平。与缺血组相比，厄贝沙坦组BrdU+细胞数在缺血后3 d、7d、14d分别增加了50％（P<0．01）、54％（P<0．01）、44％（P<0．05），3d和7d对侧海马DG区BrdU+细胞数也出现类似变化。（2）正常成年大鼠脑组织新生微血管数少量。脑缺血组再灌注3d缺血灶周围CD31+细胞数显著增多；与缺血组相比，厄贝沙坦组CD31+细胞数在缺血后3d显著增加（P<0．01）。结论厄贝沙坦预处理可以促进脑缺血后脑微血管和神经再生。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章:局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑内RAS变化及厄贝沙坦干预的影响
• 引言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二章:厄贝沙坦预处理对脑缺血大鼠神经细胞凋亡及其调控分子的影响
• 引言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三章:厄贝沙坦预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠脑血管和神经再生的影响
• 引言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 在读期间发表的论文
• 综述:血管紧张素受体拮抗剂神经保护作用研究进展
• 致谢