乳腺癌肺转移相关基因的研究

论文摘要

第一部分乳腺癌不同转移潜能细胞株表达差异蛋白的确定及其临床意义目的：复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科通过体内连续筛选法建立了肺高转移潜能的乳腺癌细胞MDA-MB-435HM。该细胞与其亲代细胞MDA-MB-435有相同的遗传背景但具有更高的肺转移潜能。本研究试图使用蛋白质组学技术，比较两者之间表达存在差异的蛋白，并探讨其中3个蛋白在乳腺癌中的临床意义。方法：联合使用二维电泳（2-DE）和液相色谱-质子阱-质谱分析（LC-IT-MS）确定MDA-MB-435HM细胞与其亲代细胞MDA-MB-435之间表达差异的蛋白。使用实时定量RT-PCR（real-time quantitative RT-PCR）和Western印迹的方法验证其中3个蛋白在不同转移潜能乳腺癌细胞株之间mRNA水平和蛋白水平的差异。使用免疫组化的方法检测2003年1月～2004年1月，80例乳腺癌标本中3个蛋白的表达情况。结果：共确定出11个在肺高转移细胞MDA-MB-435HM与其亲代细胞MDA-MB-435之间表达存在差异的蛋白：peroxiredoxin 6（PDX6），cathepsin D前体，热休克蛋白27（HSP27），HSP60，原肌球蛋白1（TPM1），TPM2，TPM3，TPM4，14-3-3 protein epsilon，肿瘤蛋白D54（tumor protein，D54）和α结晶蛋白B链（Alpha B-crystallin，CRAB）。实时定量RT-PCR检测显示肺高转移潜能细胞株中CRAB，HSP60和PDX6的mRNA水平分别为其亲代细胞的0.24倍、3.15倍和2.43倍。Western印迹分析表明CRAB的在MDA-MB-435HM中未见表达，但在MDA-MB-435细胞中表达；HSP60和PDX6蛋白在MDA-MB-435HM中上调。免疫组化染色显示，CRAB的阳性率在淋巴结阴性乳腺癌患者中高于在淋巴结阳性乳腺癌患者中（52.5％vs 32.5％），但差异无统计学意义（P=0.113）；HSP60的阳性率在淋巴结阴性乳腺癌患者中低于在淋巴结阳性乳腺癌患者中（32.5％vs 72.5％），差异有统计学意义（P=0.001）；PDX6的阳性率在淋巴结阴性乳腺癌患者中低于在淋巴结阳性乳腺癌患者中（35.0％vs 72.5％，P=0.002）。结论：HSP60与PDX6水平的升高可能与乳腺癌侵袭能力增加相关，具体机制尚待进一步研究。建立乳腺癌不同肺转移潜能的乳腺癌细胞，结合应用蛋白质组学技术，可以为发现乳腺癌肺转移相关预后指标提供线索。第二部分Trophinin在乳腺癌侵袭转移中的作用目的：探讨trophinin在不同肺转移潜能人乳腺癌细胞株的表达情况及该基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435增殖和侵袭转移能力的影响。方法：使用免疫荧光的方法检测trophinin在乳腺癌细胞株MDA-MB-435中的定位。通过RT-PCR的方法检测雌激素对乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-435的trophinin mRNA水平的影响。实时定量RT-PCR检测trophinin在肺高转移潜能乳腺癌细胞MDA-MB-435HM和其亲代细胞MDA-MB-435中mRNA水平的差异。基于pcDNA I-trophinin载体构建trophinin的表达载体pcDNA3.1（+）-trophinin。进一步通过基因稳定转染技术，上调MDA-MB-435细胞株的trophinin水平。观察trophinin转染后乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞增殖以及侵袭能力的改变，并运用RT-PCR和流式细胞等方法探讨其可能的分子机制。进一步建立相应的人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型以验证trophinin在体内乳腺癌移植瘤进展中的意义。结果：Trophinin蛋白定位于细胞膜和细胞质。雌二醇可以上调雌激素受体阳性的乳腺癌细胞株MCF7的trophinin mRNA水平，在20nM浓度时MCF7细胞株的trophinin mRNA水平上调达到最高水平。但雌二醇对雌激素受体阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-435的trophinin mRNA水平无明显影响。实时定量RT-PCR分析表明乳腺癌肺高转移细胞MDA-MB-435HM的trophinin mRNA水平是其亲代细胞的3.61倍。通过稳定转染方法获得trophinin更高表达的MDA-MB-435人乳腺癌细胞。RT-PCR分析表明，2个转染trophinin后的MDA-MB-435细胞克隆的trophinin mRNA水平显著上调。转染后细胞增殖速度无明显增加，流式细胞分析显示未转染MDA-MB-435细胞株、转染pcDNA3.1（+）空质粒的MDA-MB-435细胞株以及转染了pcDNA3.1（+）-trophinin的2个MDA-MB-435乳腺癌细胞克隆的S期比例无明显差异，分别为44.2％，48.6％，59.2％和45.7％。RT-PCR分析表明与细胞增殖相关的cyclin A、cyclin D1和PCNA等基因的mRNA水平在转染后无明显变化。Transwell小室体外侵袭实验显示转染组细胞有更强的侵袭能力，穿过matrigel胶的细胞数分别为平均每高倍视野（200×）81个细胞和157个细胞。Trophinin转染细胞移植瘤肺转移灶显著多于对照组。未转染组，转染空质粒组和2个转染组的裸鼠平均肺表面转移灶分别为26.3，24.5，53.8和54.4个。RT-PCR分析表明，转染后与肿瘤血管生成相关的VEGF、bFGF以及与细胞侵袭能力相关的MMP2、MMP9等的mRNA水平未见明显改变。但转染trophinin后细胞的MMP7 mRNA水平明显增高。结论：雌二醇可以调节雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株MCF7的trophinin mRNA水平，但雌二醇对雌激素受体阴性的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435的trophinin mRNA水平无明显影响。乳腺肺高转移潜能的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435HM的trophinin水平显著高于亲代细胞株的水平。转染trophinin表达载体后人乳腺癌细胞株MDA-MB-435的增殖能力无明显改变，但体外侵袭能力和裸鼠移植瘤肺转移灶明显增加。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 乳腺癌不同转移潜能细胞株表达差异蛋白的确定及其临床意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 Trophinin在乳腺癌侵袭转移中的作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 正文附图
• 附录:
• 附录1:文献综述
• 附录2:Cyclin E与乳腺癌预后的meta分析
• 附录3:研究生期间发表论文和参加会议情况
• 致谢