传染性法氏囊病病毒中等毒力病毒株（IBDV-HZV）的生物学特性研究

论文摘要

传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的急性接触性传染病，是危害世界养禽业的主要传染病之一。用活毒苗和灭活苗免疫鸡群是目前防治IBD的主要方法，但随着IBDV变异株与超强毒株的出现，免疫失败时有发生。本文对一株由分离的野毒株在鸡胚中驯化而成的中等毒力毒株IBDV-HZV株进行研究，期望为IBD的防治提供新的免疫效果好的候选疫苗株。本实验对IBDV-HZV株进行了理化特性的研究，实验结果表明：该毒株病毒液在pH2，作用60min后ELD50没有显著改变，而在pH12，作用60min后ELD50发生显著的改变，毒株表现出较强的耐酸性和不耐碱的特性；而且该毒株具备较强的耐热性，经60℃水浴30min后ELD50没有显著改变；经氯仿作用后ELD50不发生改变，且该毒株不凝集鸡红细胞，说明该毒株无囊膜。本实验将IBDV-HZV株接种雏鸡，分别从毒株安全性、接种鸡体内抗体的消长和对于强毒攻击的保护率等方面对毒株进行研究。实验结果证明：IBDV-HZV株接种雏鸡是安全、有效的。在实验中，选用市售的IBDV-B87中等毒力活疫苗作为对照，结果显示，IBDV-HZV株在安全性、免疫效力、抗体消长和病变恢复等方面均优于IBDV-B87株。同时，测得IBDV-HZV株的水平传播效果好，而且对雏鸡不造成免疫抑制。所有这些数据均说明，IBDV-HZV株是一株免疫效果较好的候选疫苗株。本实验采集接种IBDV-HZV株病毒液的SPF雏鸡法氏囊，用Trizol试剂提取病毒基因组，根据IBDV基因组序列设计并合成1对特异性引物，以IBDV-HZV株基因组为模板，利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的VP2基因cDNA产物，将PCR产物回收后经EcoRI和XbaI双酶切，再与pUC19质粒连接，转化到大肠杆菌中进行克隆、测序，将VP2基因序列与其他已发表的毒株序列进行比较，结果显示，IBDV-HZV株与已发表的超强毒株的核苷酸的同源性为99.4％，氨基酸同源性达99.6％，在VP2基因高变区具备所有的体现超强毒株特征的特征性氨基酸，并且两个亲水区和七肽区的氨基酸与超强毒株的完全相同，但IBDV-HZV株具有279N和284T特征性氨基酸，这些参数表明该毒株由超强毒株诱变而来，而且这两个特征性的氨基酸从分子水平上解释了该毒株不适应CEF增殖和致病力下降的特性，也正是这些特征性氨基酸的突变，使得该毒株在致病力下降的同时仍具有很高的免疫原性，对这些特征性氨基酸的分析结果在证实该毒株的优良性能的同时也为选育优良候选疫苗株提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 IBDV病原特性
• 1.2 IBD流行病学
• 1.2.1 自然宿主
• 1.2.2 传播媒介
• 1.2.3 潜伏期和症状
• 1.2.4 发病率和死亡率
• 1.3 IBDV血清型
• 1.4 IBDV的抵抗力
• 1.5 IBDV的致病机理
• 1.6 IBD的诊断技术
• 1.6.1 IBDV的分离
• 1.6.2 血清学和免疫学诊断技术
• 1.6.3 分子生物学诊断技术
• 1.7 IBDV的免疫抑制作用
• 1.8 IBDV的基因组结构及其编码蛋白
• 1.8.1 VP1蛋白
• 1.8.2 VP2蛋白
• 1.8.3 VP3蛋白
• 1.8.4 VP4蛋白
• 1.8.5 VP5蛋白
• 1.9 IBDV抗原与毒力变异的分子机制
• 1.10 IBDV常规疫苗
• 1.11 IBDV新型疫苗的展望
• 1.11.1 IBDV基因工程疫苗的研究
• 1.11.2 IBDV DNA疫苗的研究
• 2 材料与方法
• 2.1 毒株与细胞
• 2.2 细胞培养所需主要试剂
• 2.3 生物学特性研究所需主要试剂
• 2.4 RNA提取所需主要试剂
• 2.5 RT-PCR所需主要试剂
• 2.6 目的基因的克隆所需主要试剂
• 2.7 菌种与质粒载体
• 2.8 主要试剂的配制方法
• 2.9 主要仪器
• 2.10 病毒理化特性的测定
• 2.10.1 病毒的增殖与培养
• 50的测定'>2.10.2 ELD₅₀的测定
• 2.10.3 耐酸碱性试验
• 2.10.4 热敏感性试验
• 2.10.5 有机溶剂敏感性试验
• 2.10.6 琼脂扩散试验
• 2.10.7 病毒的凝集试验
• 2.11 IBDV-HZV株活疫苗的动物性实验
• 2.11.1 疫苗的制备
• 2.11.2 水平传播性试验
• 2.11.3 免疫抑制试验
• 2.11.4 返祖试验
• 2.11.5 反复冻融性试验
• 2.11.6 效力检验
• 2.11.7 十倍安全性试验
• 2.11.8 单剂量重复接种安全性试验
• 2.11.9 病变恢复期试验
• 2.11.10 疫苗免疫消长试验
• 2.12 IBDV-HZV株VP2基因的克隆及序列分析
• 2.12.1 病毒的增殖
• 2.12.2 核酸的提取
• 2.12.3 引物的设计
• 2.12.4 RT反应
• 2.12.5 PCR反应
• 2.12.6 电泳鉴定
• 2.12.7 PCR产物回收
• 2.12.8 酶切及回收
• 2.12.9 目的片段与酶切质粒的连接
• 2.12.10 感受态细胞的制备
• 2.12.11 转化
• 2.12.12 质粒回收
• 2.12.13 质粒酶切
• 2.12.14 酶切鉴定
• 2.12.15 序列分析
• 3.结果与分析
• 3.1 病毒理化特性的测定结果
• 3.1.1 病毒的增殖结果
• 50的测定结果'>3.1.2 IBDV-HZV株ELD₅₀的测定结果
• 3.1.3 理化特性的测定结果
• 3.1.4 琼脂扩散试验结果
• 3.1.5 病毒的凝集试验结果
• 3.2 IBDV-HZV株活疫苗的动物接种性实验结果
• 3.2.1 水平传播试验结果
• 3.2.2 免疫抑制试验结果
• 3.2.3 返祖试验结果
• 3.2.4 反复冻融性试验结果
• 3.2.5 免疫效力试验结果
• 3.2.6 疫苗十倍安全性试验结果
• 3.2.7 疫苗单剂量重复接种安全性试验结果
• 3.2.8 病变恢复期试验结果
• 3.2.9 疫苗免疫消长试验结果
• 3.3 IBDV-HZV株VP2基因的克隆及序列分析结果
• 3.3.1 RT-PCR产物
• 3.3.2 重组质粒酶切结果
• 3.3.3 IBDV-HZV株VP2基因的核苷酸序列测定结果
• 3.3.4 IBDV-HZV株VP2基因的氨基酸序列对比结果
• 3.3.5 IBDV毒株VP2基因的核苷酸和氨基酸同源性比较结果
• 3.3.6 IBDV毒株VP2基因的系统进化分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 作者简历
• 在读期间发表的论文
• 致谢
• 附录