cry2Aa9m、cry1Iem抗虫基因对大豆的遗传转化及转基因株系的培育

论文摘要

大豆（Glycine max（L.）Merr.）是重要的油料作物和粮食作物,是人类赖以生存的主要蛋白质来源。大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella（Mats.））在东北大豆产区普遍发生,给大豆生产带来重大损失。大豆食心虫属鳞翅目（Lepidoptera）、小卷蛾科（Olethreutidae）,是大豆的主要蛀荚害虫之一,其幼虫专门取食大豆荚部和籽粒,增加籽粒的破损率,造成虫口和碎粒,严重降低大豆的品质和产量。防治大豆食心虫的传统策略是喷洒化学农药、生物防治和杂交育种培育抗虫新品种。喷洒化学农药防治,易破坏生态平衡造成污染环境;生物防治见效慢、杀虫谱窄、受环境影响大,应用受制约;而杂交育种周期长、成本高,还受基因资源的限制,也不能在短期内获得理想的抗虫新品种。通过基因工程手段进行抗虫新品种培育,将是大豆新品种选育和种质资源创新的重大方向。本研究构建了由豆荚特异性启动子Pmsg和种子特异性启动子PGy2调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A和pCGB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标记,通过农杆菌介导法对大豆子叶节进行遗传转化,获得大量抗性株系。经PCR和RT-PCR检测,结果证明cry2Aa9m基因已经整合到大豆基因组中并得以表达;通过大豆食心虫抗虫性检测,得到抗虫效果较好的转cry1Iem基因植株,为大豆抗病虫基因工程研究奠定了基础。获得的主要研究结果如下:1.组织特异性植物表达载体的构建构建了由豆荚特异性启动子Pmsg和种子特异性启动子PGy2调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A和pCGB2A。2.大豆的遗传转化及抗性植株再生确定了丛生芽分化阶段绥农28、合丰50的固杀草Glufasinate筛选浓度分别为 1.5 mg/L 与 3.0 mg/L。以大豆品种绥农28、合丰50子叶节为受体材料,采用农杆菌介导法将含组织特异性启动子（Pmsg/PGy2）、抗虫（cry2Aa9m/cry1Iem）基因、抗除草剂（bar）基因的T-DNA片段导入大豆,获得抗性植株。3.抗性植株的分子生物学检测采用PCR和RT-PCR方法对抗性植株T0、T1代进行检测,获得了转化质粒pCGB2A的T0代转基因植株2株,T1代转基因植株1株;获得了转化质粒pCMB2A的T0代转基因植株6株,T1代转基因植株4株;获得了转化质粒pCMBA的T0代转基因植株1株,T1代转基因植株4株。4.转基因植株抗虫性检测对PCR稳定的转cry1Iem基因的15个株系进行人工网室接虫检测,得到具有高抗虫性表现的植株3株,具有抗虫性表现的植株5株,具有中抗性植株3株。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 本研究的目的意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 大豆食心虫及其防治策略
• 1.2.2 Bt基因及转Bt基因植物研究进展
• 1.2.3 大豆再生体系和遗传转化体系
• 1.3 课题来源及本论文主要研究内容
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 本论文的主要研究内容及技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 虫试材料
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 组织特异性植物表达载体构建
• 2.2.2 农杆菌介导子叶节遗传转化及抗性植株再生
• 2.2.3 抗性植株分子生物学检测
• 2.2.4 转基因植株抗虫性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.1.1 豆荚特异性启动子植物表达载体pCMB2A构建
• 3.1.2 种子特异性启动子植物表达载体pCGB2A构建
• 3.1.3 重组载体转化农杆菌EHA105受体细胞
• 3.2 农杆菌介导子叶节转化及抗性植株再生
• 3.2.1 大豆子叶节Glufosinate筛选压力的确定
• 3.2.2 抗性植株再生
• 3.3 抗性植株PCR检测
• 0代抗性植株PCR检测'>3.3.1 T₀代抗性植株PCR检测
• 1代转基因植株PCR检测'>3.3.2 T₁代转基因植株PCR检测
• 1代转基因植株RT-PCR检测'>3.3.3 T₁代转基因植株RT-PCR检测
• 3.4 转基因植株抗虫性检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介