鸡传染性法氏囊病病毒JS株VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性

论文摘要

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease, IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的鸡的主要传染性疾病之一,已造成世界养鸡业的巨大经济损失。该病主要侵害3-12周龄的雏鸡与青年鸡的法氏囊器官,导致不同程度的免疫抑制,从而增加宿主对并发和继发性病毒或细菌感染的易感性。VP2蛋白是IBDV的主要结构性蛋白,具有良好的抗原性,并且在宿主体内可诱导产生中和抗体,因此VP2基因是研究IBDV疫苗的重要目的基因。根据GeneBank已发表的VP2（Accession No. M64285）基因序列合成一对引物,用RT-PCR技术从IBDV JS株扩增出VP2基因,并克隆入pGEM-T Easy载体。序列分析结果表明,IBDV JS株氨基酸序列与各超强毒株的同源性达到94.8%以上。将VP2基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/zeo（-）中构建真核表达质粒pcDNA3.1-VP2,并转染进入HEK-293细胞进行暂态表达。48h后用间接免疫荧光技术可检测到VP2蛋白在H3K-293细胞胞浆中成功表达,证明该VP2片段具有良好的抗原性,可作为研制IBDV重组腺病毒工程疫苗的目的基因。将VP2基因插入到穿梭载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-VP2。线性化的重组穿梭质粒转化BJ5183感受态细胞,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行菌内同源重组,得到重组质粒rAd-VP2。用线性化的rAd-VP2转染HEK-293细胞,筛选得到表达VP2的重组腺病毒。噬斑纯化后的重组病毒在HEK-293细胞上传至第5代,其病毒滴度为107.8/mL TCID50。PCR方法分析结果进一步证实,重组病毒含有VP2基因,可以检测出特异目的条带并且测序完全正确;用抗IBDV特异性单克隆抗体进行IFA研究证明,感染重组病毒的细胞呈现亮绿色荧光,提示IBDV VP2在细胞中获得表达;Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子量约为40kDa。将感染重组腺病毒的细胞免疫Balb/c小鼠,采集小鼠血清进行病毒中和试验,结果表明重组病毒表达的IBDV VP2蛋白能刺激小鼠产生针对IBDV VP2蛋白的中和抗体。本研究结果为IBDV重组腺病毒疫苗的进一步研究奠定了基础。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 鸡传染性法氏囊病的现状以及疫苗研究进展
• 1 IBD 的流行病学
• 2 IBDV 形态结构
• 3 IBDV 基因组结构
• 4 IBDV 编码的蛋白
• 5 IBDV 在细胞中增殖的分子机制
• 6 IBDV 疫苗研究进展
• 7 展望
• 研究内容
• 第一章 IBDV VP2 基因的克隆与序列分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 小结与讨论
• 第二章 IBDV VP2 基因重组腺病毒的构建及其免疫特性
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢