论文摘要
目的:体外培养前脂肪细胞并与纤维蛋白凝胶复合,研究前脂肪细胞在纤维蛋白凝胶上的黏附,增殖,诱导分化为脂肪细胞的情况。探索将纤维蛋白凝胶作为前脂肪细胞载体的可行性。为前脂肪细胞和纤维蛋白凝胶复合移植预防硬膜外瘢痕形成提供理论和实践基础。方法:（1）3T3-L1前脂肪细胞株的培养:前脂肪细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃细胞培养箱（5%二氧化碳）中培养,每2天换一次培养液,传代扩增至实验所需细胞数量。（2）实验分为两个阶段:1)前脂肪细胞培养阶段;2)诱导分化阶段。第一阶段实验分组:A组为前脂肪细胞纤维蛋白凝胶复合组,B组为单纯前脂肪细胞对照组。将培养瓶中生长状况良好处于对数生长期的前脂肪细胞用0.25%的胰酶消化,显微镜下计数并制成密度为1×105个/ml的单细胞悬液备用。将纤维蛋白原用含10%胎牛血清的DMEM培养液充分溶解,配制成浓度为75mg/ml的纤维蛋白原溶液,凝血酶用40mmol/L的氯化钙溶液溶解,配制成浓度为100u/ml的凝血酶溶液。先后向24孔板内加入前脂肪细胞的单细胞悬液100ul、纤维蛋白原溶液200ul和凝血酶溶液100ul,均匀混合后于37℃的细胞培养箱中静置10分钟制成前脂肪细胞纤维蛋白凝胶复合物,再另将100ul前脂肪细胞的单细胞悬液加入24孔板内为对照组培养,A、B两组细胞各24孔。利用倒置相差显微镜观察不同时间点的A、B两组中前脂肪细胞的黏附、生长、增殖情况。分别于实验的第1、3、5、7、9、11、13天取A、B两组各3孔中的前脂肪细胞,采用MTT法检测细胞的相对数量。随机取A、B两组中各3孔的细胞,向每孔中加入噻唑蓝溶液（5mg/ml）100ul后,移入37℃细胞培养箱中静置4小时,然后吸弃培养孔中的上清液,向每孔再加入10%的二甲基亚砜（DMSO）溶液500ul,振荡10分钟,使结晶物充分溶解后,每孔取150ul转入96孔板中,于570nm波长下测定各孔的光密度（OD）值,统计后绘制A、B两组中前脂肪细胞的生长曲线。第二阶段实验分组:C组为前脂肪细胞纤维蛋白凝胶诱导分化组,D组为单纯前脂肪细胞诱导分化组,E组为从纤维蛋白凝胶上消化的前脂肪细胞诱导分化组。诱导分化都在24孔板中进行,每组各18孔,每孔接种的前脂肪细胞数为5×104个。细胞接种第5天后加入含诱导分化剂（含0.5mmol/L的IMBX、5mg/L的胰岛素和1umol/L的地塞米松）的培养液,利用倒置相差显微镜观察C、D、E3组不同时间点前脂肪细胞的分化情况,于诱导分化后第1、6、12天随机取C、D、E三组中各5孔细胞,采用油红O染色提取法测定各组中脂肪细胞内的脂肪含量。先将C、D、E组标本用10%的中性甲醛固定10分钟,PBS液漂洗后加入配制好的油红O染料浸没标本10分钟,再用PBS液洗去未着色的油红O残渣。然后将已染色的培养板置于37℃细胞培养箱内蒸发掉板内的水分,随即每孔加入1ml异丙醇静置30分钟,萃取脂肪细胞中的油红O染料,萃取出的染液用吸管移出,于722型分光光度计510nm波长处测量吸光度,以OD值表示C、D、E3组中脂肪细胞的脂肪的相对含量。结果:从生长曲线可以看出,A组即复合在纤维蛋白凝胶上的前脂肪细胞具有良好的增殖能力,接种11天后纤维蛋白凝胶上的前脂肪细胞数高于B组孔板内培养的前脂肪细胞数（P<0.05）。倒置相差显微镜观察C组即前脂肪细胞纤维蛋白凝胶复合诱导组在加入诱导分化剂10天后可见部分细胞分化为脂肪细胞,而另外D、E两组在加入诱导剂4天后可见分化的脂肪细胞,E组从纤维蛋白凝胶上消化下来的前脂肪细胞具有与D组孔板中培养前脂肪细胞相当的分化能力,在6天和12天两个时间点上D、E两组之间的脂肪含量无显著性差异。结论:纤维蛋白凝胶与前脂肪细胞有良好的生物相容性,可作为前脂肪细胞的载体,是组织工程脂肪可行的支架材料。与正常孔板内培养的前脂肪细胞相比,纤维蛋白凝胶中的前脂肪细胞诱导分化率偏低,纤维蛋白凝胶可能对前脂肪细胞分化存在抑制作用,复合在纤维蛋白凝胶上的前脂肪细胞在体内的增殖和分化还需作进一步的动物体内研究。