论文摘要
临床上,供体器官的严重短缺,使人们将目光转向了异种移植。到目前为止,猪被认为是最适合的异种移植供体。猪内源性反转录病毒（Porcine endogenous retrovirus, PERV）是指以前病毒DNA形式整合进猪细胞基因组中,并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。目前国内外对PERV的研究均着眼于异种移植中其病原安全性的评价等方面,至今尚未见有利用其作为反转录病毒载体的报道。由于PERV来源于猪基因组,因此利用其构建的载体系统与猪基因组存在同源序列,通过基因的同源重组会更有利于外源基因的高效定点整合,通过载体元件的优化,也有可能大大提高表达效率。本研究构建了以PERV长末端重复序列（Long terminal repeat, LTR）为转录调控序列的反转录病毒载体。主要进行以下工作:1猪内源性反转录病毒载体的构建以我国特有五指山猪（WZS）来源的PERV和小鼠干细胞病毒（Murine Stem Cell Virus, MSCV）载体为基础,利用PERV的5′LTR与3′LTR及5′UTR加上gag基因的一部分与3′LTR分别替换MSCV载体的相应区域,构建猪内源性反转录病毒载体,将其命名为PM-1和PM-2,并且在PM-1和PM-2载体的多克隆位点插入GFP基因构建了PM-1-GFP-21和PM-2-GFP-1反转录病毒表达载体。2猪内源性反转录病毒载体表达系统的评价将pPM-1-GFP-21,pPM-2-GFP-1转染PK15细胞后,通过PCR及Southern blotting进行鉴定,证实载体能够成功转移并表达外源基因,并且具有稳定整合外源基因至PK-15基因组中的能力。同时,对PM-1和PM-2载体的被包装能力进行初步评价,将pPM-1-GFP-21和pPM-2-GFP-1分别与pGag-Pol及pVSV-G三质粒共转染HEK293-T细胞,继而用细胞上清感染PK-15细胞,结果未检测到GFP基因的表达。将pPM-2-GFP-1与pVSV-G共转染PK-15细胞,取转染后的细胞上清感染PK-15细胞,同时加入polybrene促进病毒粒子的吸附,结果仍未检测到GFP基因的表达。本实验成功构建了两个基于PERV转录调控序列的反转录病毒载体PM-1和PM-2,并证实载体能稳定整合入细胞基因组DNA,可持续表达外源目的基因。异源的转录调控序列与结构蛋白包装质粒可能无法结合在一起,而有必要构建与其反转录病毒载体同源的结构蛋白包装质粒来完成载体的正确包装。本研究结果为进一步实施转基因猪的研究提供一种新的思路。
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标签：猪内源性反转录病毒论文; 长末端重复序列论文; 反转录病毒载体论文;