TRPC6在足细胞的表达及其与足细胞损伤修复相关性研究

论文摘要

目的:足细胞的裂孔隔膜（slit diaphragm, SD）是肾小球滤过屏障的关键组成部分,新近发现的裂孔隔膜蛋白[1,2]瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（transient receptor potential cation channel 6, TRPC6）是一个非选择性阳离子通道蛋白,它与Nephrin、Podocin等重要的裂孔隔膜分子共同组成一个信号传导复合物（signaling complex）以维持足突及裂孔隔膜结构和功能的完整性。本文旨在探讨TRPC6蛋白在小鼠足细胞系MPC5（mouse podocyte clone 5,MPC5）的表达及其表达变化与足细胞损伤、修复的相关性。方法:1、条件永生型小鼠足细胞系MPC5培养:根据文献[3]将复苏MPC5细胞,于33℃中增殖培养,平均3～4天达80%以上融合传代。换于37℃中培养,10～14天分化为成熟,此时为分化态MPC5,用于实验;2、通过反转录酶—聚合酶链反应（ RT—PCR）、免疫蛋白印迹（Western blotting）检测TRPC6在分化态MPC5的表达;3、TRPC6与足细胞骨架蛋白关系研究:将分化态MPC5分两组,正常对照组（组1）不做任何处理,细胞松解素处理组（组2）加细胞松解素D（cytochalasin D） （2.5μmol/mL）作用6小时,用Western blotting方法检测两组TRPC6的表达量;4、TRPC6与足细胞损伤及修复研究:建立正常对照组,嘌呤霉素核苷酸（PAN）肾病足细胞模型组,地塞米松干预组（0.01μmol/L,7 d）,卡托普利干预组（10μmol,12 h、24 h、48 h、72 h）,全反式维甲酸（ATRA）干预组（0.2μmol,24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）,用Western blotting方法检测各组TRPC6的表达量。结果:1、MPC5细胞在33℃有γ-INF的培养液中生长,细胞体小而突起,细胞间排列紧密,呈鹅卵石样,部分区域有管腔样结构,足突样结构少见,平均3～4天即达到90%融合,在37℃无γ-INF条件培养下的足细胞较33℃的胞体透明,呈多角形,细胞间相对疏松,管腔样结构增多,生长速度明显减缓,3～4天后细胞即停止增殖,1周后大量星型细胞样细胞形成,树枝状的足突结构明显,细胞间可见足突互相接触,10～14天分化成熟;2、在分化态MPC5检测到特异性的TRPC6基因的RT—PCR产物条带为181 bp,与所设计的PCR产物大小一致,测序结果与Genebank上的mRNA序列完全一致。Western blotting法检测到特异性的相对分子质量为110 KD的TRPC6蛋白条带;3、细胞松解素D处理组（组2）的TRPC6蛋白表达量较正常对照组（组1）显著增加（P <0.01）;4、TRPC6蛋白在PAN模型组表达量较正常对照组显著增加（P<0.01）;5、三组药物干预组结果如下:（1）地塞米松干预组TRPC6蛋白表达量较正常对照组增加有统计学意义（P<0.05）,而较PAN模型组显著减少（P<0.01）;（2）TRPC6蛋白在卡托普利干预组的表达量较正常对照组增加有统计学意义（P<0.05）,较PAN模型组减少有统计学意义（P<0.05）,其中干预24 h组的表达量较PAN模型组减少幅度最大（P<0.01）,与正常对照组最接近。卡托普利干预组各组间比较,24 h较另外3组显著减少（P<0.01）;（3）TRPC6蛋白在ATRA干预组的表达量较正常对照组增加有统计学意义（P<0.05）,较PAN模型组减少有统计学意义（P<0.05）,其中干预72 h组的表达量较PAN模型组减少幅度最大（P<0.01）,与正常对照组最接近。ATRA干预组各组间比较,72 h较另外4组显著减少（P<0.01）。结论:1、从mRNA水平及蛋白水平证实,在分化态MPC5能正常表达TRPC6基因和蛋白质。2、TRPC6蛋白在细胞松解素D及PAN引起的足细胞损伤时其表达显著增加;而受损足细胞经地塞米松、卡托普利、ATRA干预治疗后,TRPC6蛋白表达均较受损时明显减少;3、卡托普利和ATRA的干预治疗与TRPC6蛋白表达量存在时效性,作用效果最显著时间:卡托普利为24 h,ATRA为72 h。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢
• 四、缩略语表