Syndecan-1与炎症性肠病关系的实验研究

论文摘要

研究背景与目的Syndecan-1（CD138）是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的成员,生理状态下主要表达于上皮细胞表面。Syndecan-1是由跨膜的核心蛋白和连接于核心蛋白上的硫酸乙酰肝素（HS）链及硫酸软骨素（CS）链组成。核心蛋白包括胞内区、跨膜区和胞外区。HS链和CS链连接于Syndecan-1核心蛋白的胞外区。由于HS链及CS链上硫酸基团修饰的数目和位置不同,胞外区具有高度可变性。完整的HS链是Syndecan-1发挥作用的主要部分,能与细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞外基质及细菌表面肝素结合蛋白等结合,在维持细胞形态、促进组织修复、调节免疫功能中起重要作用。Syndecan-1的跨膜区和胞内区具有高度保守性,跨膜区参与Syndecan-1二聚体及多聚体的形成,胞内区可结合细胞骨架肌动蛋白,参与细胞骨架形成。Syndecan-1的核心蛋白与HS链是上皮细胞紧密连接的重要组成部分,在维持上皮屏障功能中发挥重要作用。生理状态下,大部分Syndecan-1表达于细胞膜上,仅有少量Syndecan-1在某些切割酶类（基质金属蛋白酶-7等）的作用下被切割而脱落,成为游离的Syndecan-1胞外功能区。脱落的Syndecan-1可被吸收入血。与此同时,细胞内又合成新的Syndecan-1以补充细胞膜表面缺失的Syndecan-1。单核细胞等分泌的IL-1可增强基质金属蛋白酶的表达。游离的Syndecan-1蛋白包含有完整的硫酸乙酰肝素（HS）链,即Syndecan-1发挥作用的部分。Syndecan-1在炎症反应的许多环节中发挥作用:表达于上皮细胞膜上的Syndecan-1是肠黏膜屏障的组成部分,阻止致炎因素作用于肠道。游离的Syndecan-1可抑制白细胞—内皮细胞间相互作用;与趋化因子结合趋化中性粒细胞到达炎症部位;抑制T细胞的迁移;增强FGF-2介导的有丝分裂,促进炎症时组织修复;促进病原菌所致的机体感染。炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）,是结肠非特异性免疫反应性炎症,其确切的病因和发病机制至今还不清楚,可能是环境因素作用于遗传易感人群所致。研究发现肠黏膜屏障功能破坏可使肠道渗透性增强,从而使环境因素作用于肠道,激活肠道固有免疫细胞,分泌炎性因子（IL-1等）,在肠道先天性免疫的基础上激发了肠道获得性免疫,最终导致肠道炎症性改变。目前IBD在诊断和病情监测中缺乏特异性指标,治疗上也缺乏有效的药物。国外一些学者研究了Syndecan-1与普通炎症的关系,但Syndecan-1与IBD的关系国内外都罕有报导。鉴于Syndecan-1与炎症发生的各个环节均有密切的关系,且是肠黏膜屏障的重要组成部分,我们推测Syndecan-1在IBD的发生发展中应起一定的作用。由于IL-1是IBD发病中的重要促炎因子,可增强基质金属蛋白酶-7（MMP-7）等的表达,而MMP-7能切割Syndecan-1使其脱落,我们推测IL-1调节了Syndecan-1在IBD中的作用。葡聚糖硫酸钠（DSS）及三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠结肠炎症是目前公认的研究IBD的动物模型。前者诱导的肠炎类似于人类UC,后者诱导的肠炎类似于人类CD。基于以上的研究背景,本研究探讨了Syndecan-1在两种发病机理不同的小鼠IBD发生发展过程中的作用。内容包括:1.用DSS及TNBS诱导两种发生机理不同的小鼠IBD。2.监测两种小鼠IBD模型中,结肠粘膜及血清Syndecan-1蛋白水平的变化。3.监测两种小鼠IBD模型中,结肠粘膜Syndecan-1、IL-1、MMP-7 mRNA表达的变化。方法1.用DSS制备小鼠IBD:将40只BALB/c小鼠随机分为正常对照组和模型1、2、3组,每组10只。模型组小鼠自由饮用4%DSS溶液（蒸馏水配制）7d后饮用蒸馏水10d,再饮用4%DSS溶液7d。对照组小鼠正常饮食,饮蒸馏水。分别于第8d、18d、25d处死1、2、3组小鼠。对照组小鼠于第8d处死。观察各组小鼠疾病活动度,肉眼观察结肠大体改变,用光学显微镜观察小鼠结肠病理学变化。2.用TNBS制备小鼠IBD:将50只BALB/c小鼠随机分为正常对照组和模型1、2、3、4组,每组10只。模型组小鼠以100μl的TNBS乙醇溶液灌肠,对照组小鼠100μl的生理盐水灌肠。分别于造模后3天、7天、14天、21天处死各组小鼠,对照组小鼠于第3天处死。观察各组小鼠疾病活动度,肉眼观察结肠大体改变,用光学显微镜观察小鼠结肠病理学变化。3.免疫组化检测各组小鼠结肠黏膜Syndecan-1蛋白水平的变化。4.RT-PCR检测各组小鼠结肠黏膜Syndecan-1mRNA、IL-1、MMP-7 mRNA表达的变化。5.Dot-blot检测各组小鼠血清中Syndecan-1蛋白水平的变化。6.统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计学分析:若数据服从正态分布,以（?）±S表示,进行单向方差分析及两独立样本T检验;若数据不服从正态分布,以中位数表示,进行多个独立样本及两独立样本的非参数检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.DSS及TNBS模型组小鼠疾病活动度指数（DAI）评分均高于对照组（χ2=35.058,P＜0.001;χ2=43.053,P＜0.001）。DSS造模第8天及TNBS造模后3天处死的小鼠DAI评分最高,此后随着造模时间延长,评分逐渐减低。DSS模型组部分小鼠出现中毒性巨结肠。2.DSS及TNBS模型组小鼠结肠组织学评分均明显高于对照组（χ2=36.828,P＜0.001;χ2=43.969,P＜0.001）。DSS造模第8天及TNBS造模后3天处死的小鼠组织学评分最高,此后随着造模时间延长,评分逐渐减低。DSS模型组小鼠结肠上皮和腺体结构破坏,黏膜至黏膜下层炎细胞浸润;TNBS模型组小鼠结肠可见裂隙溃疡,结肠全层炎细胞浸润。3.DSS及TNBS模型组小鼠肠粘膜Syndecan-1蛋白水平均明显低于对照组（Welch=1893.280,P＜0.001;Welch=2328.127,P＜0.001）。DSS造模第8天及TNBS造模后3天处死的小鼠肠粘膜Syndecan-1蛋白水平最低,此后随着造模时间延长,蛋白水平逐渐回升。4.DSS及TNBS模型组小鼠与正常对照组小鼠相比肠黏膜Syndecan-1mRNA表达水平无统计学差异（F=0.809 P＞0.05;F=0.815 P＞0.05）;DSS及TNBS模型组小鼠肠黏膜IL-1 mRNA表达水平均高于对照组（F=103.833,P＜0.001;F=88.015,P＜0.001）,以DSS造模第8天及TNBS造模后3天处死的小鼠IL-1mRNA表达水平最高,之后随着结肠炎症的减轻,IL-1 mRNA的表达水平逐渐下降。DSS及TNBS模型组小鼠肠黏膜MMP-7 mRNA表达水平均高于正常对照组（t=-5.098,P＜0.05;t=-6.153,P＜0.05）。5.DSS及TNBS模型组小鼠血清中游离Syndecan-1蛋白水平均高于对照组（F=32.399 P＜0.001;F=27.881,P＜0.001）。以DSS造模第8天及TNBS造模后3天处死的小鼠血清中游离Syndecan-1蛋白水平最高,此后随着造模时间延长,游离Syndecan-1蛋白水平逐渐减低。结论本研究探讨了Syndecan-1在IBD发生发展中的变化及意义,这在国内外尚属首次。通过研究得出以下结论:1.DSS和TNBS能够成功诱导出两种不同类型的小鼠IBD。DSS诱导的炎症类似于人类UC,TNBS诱导的炎症类似于人类CD。2.DSS和TNBS诱导的IBD疾病活动度和结肠炎症均随造模时间延长而减轻。DSS模型小鼠疾病活动度和结肠炎症于造模第8天达到高峰,TNBS模型小鼠疾病活动度和结肠炎症于造模后3天达到高峰。此后随着造模时间延长,疾病活动数减低,结肠炎症也逐步减轻。3.结肠黏膜Syndecan-1蛋白水平减低与IBD炎症的严重程度密切相关。在DSS和TNBS诱导的小鼠IBD中,结肠黏膜Syndecan-1蛋白水平均低于正常对照组。在IBD结肠炎症最严重时（DSS造模第8天和TNBS造模后3天）Syndecan-1蛋白水平最低,随着结肠炎症的减轻Syndecan-1蛋白水平逐步回升。4.IBD时,结肠黏膜Syndecan-1蛋白水平减低不是由结肠黏膜Syndecan-1mRNA表达水平减低引起,而是由结肠黏膜Syndecan-1蛋白脱落增加所引起。在DSS和TNBS诱导的小鼠IBD中,结肠黏膜Syndecan-1蛋白水平减低的同时,结肠黏膜Syndecan-1 mRNA水平与正常对照组相比没有明显差异,但小鼠血清中游离Syndecan-1蛋白水平升高。结肠黏膜Syndecan-1蛋白水平最低时,小鼠血清中游离Syndecan-1蛋白水平最高。随着结肠黏膜Syndecan-1蛋白水平升高,血清中游离Syndecan-1蛋白水平也逐步减低。5.IBD时,结肠黏膜Syndecan-1蛋白脱落增加与结肠黏膜IL-1及MMP-7表达增强有关。有研究证实IL-1可诱导MMP-7表达,而MMP-7可切割结合于细胞膜上的Syndecan-1蛋白使其脱落。本研究中,在IBD小鼠结肠粘膜IL-1高表达时MMP-7表达水平升高,此时结肠粘膜Syndecan-1蛋白水平减低且血清中游离Syndecan-1蛋白水平升高,说明Syndecan-1蛋白脱落增加的机制之一是:MMP-7的高表达致使MMP-7对Syndecan-1蛋白的切割作用增强,使更多的Syndecan-1蛋白从细胞膜表面脱落。MMP-7的高表达可能与IL-1表达增强有关。6.血清中游离Syndecan-1蛋白有可能作为IBD诊断及预后的指标。在IBD结肠炎症最严重时,小鼠血清中游离Syndecan-1蛋白水平最高;在IBD炎症逐步减轻的同时,小鼠血清中游离Syndecan-1蛋白水平又逐步下降。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第1章 用葡聚糖硫酸钠和三硝基苯磺酸诱导小鼠炎症性肠病
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 Syndecan-1在小鼠炎症性肠病中的变化及意义
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 英文缩略语词对照表
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明