论文摘要
油菜是世界四大主要油料作物之一,也是我国最为重要的油料作物之一。甘蓝型油菜（Brassica napus）其黄籽类型与黑籽类型相比有着许多品质优势,如具有种皮色素少、种皮薄、纤维素含量低以及蛋白质和含油量高等优点,近年来颇受研究人员重视。甘蓝型油菜黄籽形成的机理目前还不清楚,但油菜与拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）同属于十字花科,且甘蓝型油菜种皮色泽形成方式与拟南芥很相似,因此可以借鉴拟南芥透明种皮（TRANSPARENT TESTA,TT）分子生物学研究的成果开展甘蓝型油菜种皮色泽分子机制的研究。查尔酮合酶（Chalcone synthase,CHS）是植物类黄酮途径的第一个关键酶,参与种皮颜色、花色、茎表和叶表花青素着色等重多类黄酮相关性状的形成,拟南芥CHS（AtCHS）被鉴定为TT4位点。研究油菜CHS基因有助于进一步了解甘蓝型油菜黄籽等诸多类黄酮相关性状形成的分子机制,为通过分子技术修饰甘蓝型油菜的这些性状奠定基础。本研究克隆了甘蓝型油菜CHS基因家族8个成员的全长cDNA和6个成员的基因组序列,并对其序列及编码蛋白进行了系统的分析;构建了甘蓝型油菜CHS基因家族反义植物表达载体,并转化了黑籽甘蓝型油菜品种中油821。主要结果如下:1.甘蓝型油菜CHS基因家族成员全长cDNA和基因组序列的克隆在对多种植物的CHS基因进行多重比对后,设计了RACE引物,以甘蓝型油菜总cDNA第一链为模板,扩增得到了12个5’端序列和12个3’端序列,均与拟南芥CHS基因高度同源。据此设计相应了5’末端引物和3’末端引物,分别从总cDNA模板中扩增得到BnCHS1（1450bp）、BnCHS2（1430bp）、BnCHS3（1496bp）、BnCHS4（1485bp）、BnCHS5（1338bp）、BnCHS6（1314bp）、BnCHS7（1434bp）和BnCHS8（1481bp）的全长cDNA,从基因组总DNA模板中扩增出BnCHS1（1506bp）、BnCHS2（1490bp）、BnCHS3（1743bp）、BnCHS4（1752bp）、BnCHS5（1401bp）和BnCHS6（1372bp）的基因组序列,BnCHS7和BnCHS8的基因组序列暂未得到。8个BnCHS基因的结构符合CHS基因的典型特征,且与AtCHS和其它植物CHS基因存在广泛的同源性。2.BnCHS基因家族8个成员编码蛋白的结构BnCHS1编码一个395个氨基酸的多肽链,分子量（Mw）=43.02kDa,等电点（pI）=5.92;BnCHS2编码一个395个氨基酸的多肽链,Mw=43.05kDa,pI=5.92;BnCHS3编码一个394个氨基酸的多肽链,Mw=42.93kDa,pI=6.16;BnCHS4编码一个396个氨基酸的多肽链,Mw=43.14kDa,pI=6.03;BnCHS5编码一个394个氨基酸的多肽链,Mw=43.01kDa,pI=5.92;BnCHS6编码一个394个氨基酸的多肽链,Mw=43.09kDa,pI=6.29;BnCHS7编码一个396个氨基酸的多肽链,Mw=43.15kDa,pI=6.61;BnCHS8编码一个396个氨基酸的多肽链,Mw=43.24kDa,pI=6.41。8个BnCHS蛋白中均是酸性氨基酸含量略高于碱性氨基酸,疏水氨基酸比例为36%左右。8个BnCHS蛋白序列中均有较多的潜在磷酸化位点,都没有信号肽。预测8个BnCHS蛋白都定位于细胞浆,但却均预测含有1～3个跨膜螺旋,说明8个BnCHS蛋白成员可能是与膜有联系的主体位于胞浆的蛋白。8个BnCHS蛋白的二级结构非常相似,主要含有大量的a-螺旋,随机卷曲穿插在其中。8个BnCHS蛋白的三级结构几乎完全相同,并与ExPDB模型库中的已有CHS蛋白的晶体模型相似谱有较高的一致性。8个BnCHS蛋白特征与AtCHS和其它植物CHS蛋白的特征一致。3.BnCHS基因家族的同源性和进化特征BnCHS的1～8号成员与AtCHS具有很高的同源性,基因组水平的同源性为73.2%～83.5%,ORF区域的一致性为83.4%～88.5%。变异主要是位于非编码区,5’UTR的一致性为53.9%～69.2%,3’UTR的一致性为54.3%～69.9%,内含子的一致性为25.5%～59.1%。BnCHS1～BnCHS8与拟南芥CHS（AtCHS）的蛋白同源性都很高,氨基酸一致性分别达到95.7%、95.4%、94.7%、93.9%、86.8%、86.3%、94.9%、95.2%,相似性分别达到96.7%、96.7%、96.2%、96.2%、92.7%、91.9%、96.5%、96.7%。BnCHS家族在蛋白水平与拟南芥CHS具有比核苷酸水平高得多的一致性和相似性,氨基酸水平的变异多为相似氨基酸之间的取代,说明CHS蛋白功能保守,也暗示所克隆的8个BnCHS蛋白成员应当具有与AtCHS相似的酶活性。系统发生分析表明,BnCHS基因家族是AtCHS的垂直同源基因,BnCHS基因家族的成员数符合芸薹族基因组“三倍化”的假说,而且十字形花科祖先中很可能已经有2条CHS基因了。这8个BnCHS基因组成4个姊妹组,每个姊妹组内的两个成员间的高度同源明显高于姊妹组间的同源性,符合甘蓝型油菜作为异源四倍体的特征。4.BnCHS家族反义表达载体的构建将BnCHS基因家族共保守的806bp的反义链片段接到中间表达载体pCambia2301G中,替换其上面的GUS基因,形成CaMV 35S启动子驱动、反义共抑制所有BnCHS成员的植物表达载体,命名为pCambia2301G-BnCHSA。5.甘蓝型油菜CHS反义转化植株的获得采用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜“中油821”,获得了27株抗卡那霉素的再生苗,通过检测GUS基因在抗性植株中的稳定表达情况,发现其中1株为稳定表达的转基因植株,阳性率为3.70%。