几种诱食剂对中华倒刺鲃（Barbodes sinensis）诱食活性及神经肽Y表达的影响

论文摘要

神经肽Y（Neuropeptide Y,NPY）是一种由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统中,尤其在端脑、视前区、视顶盖以及下丘脑含量丰富。NPY与摄食行为、血压、生物节律性、呼吸调节、下丘脑神经内分泌功能以及血管收缩,平滑肌舒缩等重要的生理过程的调节密切相关。中华倒刺鲃（Spinibarbus sinensis）,主要分布于长江中上游的干、支流水域中,是我国名贵淡水野生经济鱼类,具有巨大的养殖开发前景。NPY是一种十分重要的采食量调控因子,但目前还没有从分子水平研究具体阐明NPY对中华倒刺鲃摄食的作用机制,研究诱食剂对中华倒刺鲃摄食的影响及运用分子生物学的手段研究诱食剂对NPY表达含量的影响,为进一步探讨NPY在促进中华倒刺鲃摄食上发挥的作用建立一定的分子生物学基础,以期为中华倒刺鲃等名优鱼类的养殖过程中的生物饲料技术提供理论或现实基础。本研究运用基因克隆技术克隆出了中华倒刺鲃NPY基因的特异性片段,对中华倒刺鲃幼鱼进行人工养殖及诱食剂诱食活性研究,并运用实时荧光定量PCR技术将其中几种诱食剂对中华倒刺鲃NPY表达含量进行了测定,主要研究结果如下:1.中华倒刺鲃NPY基因特异性片段的克隆在美国NCBI网站（http :/ / www. ncbi. nlm. nih. gov） Genebank数据库中查到已知中华倒刺鲃NPY基因全长cDNA序列,其序列登录号为DQ462412。利用序列,借助Primer Express 5.0软件遵循相关原则设计引物。跨基因片段一个内含子设计了一对特异性引物,以来自中华倒刺鲃脑组织的mRNA为膜板扩增得到了中华倒刺鲃NPY基因特异性片段。2.中华倒刺鲃NPY在各脑组织中的表达研究根据中华倒刺鲃NPY的cDNA序列,设计了一对特异性引物用于中华倒刺鲃NPY在各脑组织中的表达研究,此外,根据倒刺鲃属的β—actin基因cDNA序列,其序列登录号为DQ656598 ,设计了一对内参引物。PCR结果显示,在所研究的端脑、间脑、中脑、小脑及延脑组织中,均能检测到明显的NPY表达。3.中华倒刺鲃幼鱼的人工养殖及诱食剂诱食活性研究中华倒刺鲃幼鱼80尾,体长为5～8 cm。于实验室驯养两个星期,开始进行诱食剂诱食活性的研究,此研究运用到了玻璃迷宫法。在实验室放置一个玻璃材料的迷宫,每次取10尾鱼进行实验,记录对每种诱食剂实验鱼停留在有效区域内的尾数。实验进行了氨基酸、核苷酸及动植物粗提取物诱食活性实验,经过统计分析,这些诱食剂对中华倒刺鲃的诱食效果依次为蛤蜊提取液>核苷酸+甜菜碱>0.3%甜菜碱>组氨酸+甜菜碱>0.2%甜菜碱,0.5%甜菜碱>甘氨酸+甜菜碱>海带提取液,核苷酸+甘氨酸,0.1%甜菜碱,0.4%甜菜碱>甘氨酸+甜菜碱+组氨酸,甘氨酸>0.6%甜菜碱>核苷酸+组氨酸>核苷酸>甘氨酸+组氨酸>组氨酸>核苷酸+甘氨酸+组氨酸>大蒜提取液。诱食剂甜菜碱对中华倒刺鲃的诱食效果不大,且随其浓度的增大,诱食效果并不成正比增强。4.测定几种诱食剂对中华倒刺鲃NPY表达含量的影响在诱食活性研究的基础上,选取了几种促进和抑制效果明显的诱食剂作用下的中华倒刺鲃,对其进行提取脑组织,提取RNA,进行RT-PCR反应。再运用实时荧光定量PCR技术对其NPY基因表达含量进行了检测,实验数据表明,诱食剂的诱食活性强弱和NPY表达含量多少成正比例关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 中华倒刺鲃的基础生物学资料
• 1.2 神经肽Y（NPY）的研究概况
• 1.2.1 NPY 的结构与分布
• 1.2.2 NPY 基因
• 1.2.3 NPY 对采食行为的影响
• 1.2.4 鱼类NPY基因对采食行为的影响
• 1.3 水产动物诱食剂的研究概况
• 1.3.1 诱食剂的作用机理
• 1.3.2 诱食剂的作用
• 1.3.3 诱食剂的种类及应用
• 1.3.4 诱食剂的应用前景
• 2 引言
• 3 材料和方法
• 3.1 动物材料及诱食剂
• 3.1.1 动物材料
• 3.1.2 诱食剂
• 3.2 主要试剂
• 3.2.1 主要分子生物学试剂
• 3.2.2 溶液的配制
• 3.3 主要仪器
• 3.4 引物设计
• 3.5 总RNA 的制备及检测
• 3.5.1 总RNA 的制备
• 3.5.2 总RNA 的检测
• 3.6 NPY 特异性基因片段克隆的方法和程序
• 3.7 NPY 在脑组织各部分表达的操作
• 3.8 诱食剂诱食活性的研究
• 3.8.1 实验鱼和饲养条件
• 3.8.2 实验用玻璃迷宫
• 3.8.3 诱食活性实验
• 3.9 NPY 表达的荧光定量分析
• 3.9.1 标准曲线的绘制
• 3.9.2 样品定量
• 4 结果与分析
• 4.1 中华倒刺鲃总 RNA 的提取
• 4.2 NPY 特异基因片段的克隆
• 4.3 NPY 在脑组织各部分的表达
• 4.4 几种诱食剂的诱食活性比较
• 4.5 NPY 表达含量的定量分析
• 4.6 诱食剂与NPY 表达含量之间的关系
• 5 讨论
• 5.1 关于总 RNA 的提取
• 5.2 引物设计
• 5.3 PCR 反应条件优化
• 5.4 NPY 在脑组织各部分的表达
• 5.5 诱食剂诱食活性分析
• 5.6 NPY 表达的荧光定量分析
• 6 结论
• 参考文献
• 附
• 1. 缩写词
• 2. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况
• 3. 致谢