乙型肝炎病毒感染肝细胞癌患者中截短型中蛋白的研究

论文摘要

目的:分子流行病学方法检测肝癌患者中HBV病毒株MHBst的种类,并研究各种MHBst的反式激活能力及对细胞的增殖、成瘤和凋亡影响。以免疫沉淀的方法筛选MHBst167候选结合蛋白。探讨截短中蛋白在肝细胞内的可能存在的分子作用机制。方法:应用多聚酶链反应（PCR）和Alu-PCR技术自HBV感染肝癌患者外周血和肝癌组织中扩增S基因序列,并进行pMD18-T载体的TA克隆,随机选择部分克隆进行DNA测序并对测序结果进行生物信息学分析。应用GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System突变S蛋白的起始密码子,将S基因点突变成功的不同MHBst构建真核表达载体和腺病毒表达载体,转染或感染细胞后Western-blot验证其蛋白的表达。通过启动子激活萤火虫萤光素酶的表达研究不同MHBst反式激活功能。通过CCK-8、软琼脂克隆形成及TUNEL方法观察不同截短型的中蛋白对细胞增殖、成瘤及凋亡功能的影响。以免疫沉淀的方法筛选出MHBst167结合蛋白。结果:成功自80例HBV感染肝癌患者的血清中获得700多个S基因的阳性克隆,通过测序获得600条S区基因序列,发现7种分别在77,90,116,124,129,227,254处氨基酸终止编码的MHBst;其中129,227,254三种MHBst出现的频率较高,分别为15%（12/80）,7.5%（6/80）和20%（16/80）;12例MHBst129全为C基因型,6例MHBst227只有1例为B基因型,其余为C基因型,而16例254只有1例为C基因型,其余均为B基因型。Alu-PCR从30例肝癌标本中检测出3例标本有S基因的整合,共发现了9种整合位点。对8种不同MHBst和完整中蛋白成功进行了小蛋白起始密码子的突变。构建了8种不同MHBst和完整中蛋白的pCDNA3.1、p3xflag-cmv-10真核表达载体,并成功获得MOI值分别为:Ad-77:160,Ad-90:320,Ad-116:320,Ad-124:320,Ad-129:320,Ad-227:500,Ad-254:320,Ad-167:160,Ad-281:160,Ad-GFP:320的病毒液。获得了能够分别表达SV40、c-fos、c-myc启动子的细胞株。不同MHBst的反式激活能力、增殖及克隆形成能力不同。MHBst167可以通过TRAIL诱导产生细胞凋亡并可以被阻断剂PD98059。免疫沉淀方法获得了相互作用蛋白醛缩酶B。结论:HBV感染肝癌患者血清中存在7种不同类型MHBst,以C基因型出现的种类比较多。HBV感染肝癌患者发生S基因整合较少,且为随机整合,但其整合可能涉及细胞的增殖、凋亡等生物学功能。不同类型的MHBst有反式激活能力,并对细胞的增殖及凋亡的有一定影响。免疫沉淀筛选出了醛缩酶B可与MHBst167蛋白相互作用,为下一步研究提供新的线索。

论文目录

• 主要英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要材料、器材、配方、操作方法
• 1. 主要材料
• 2. 主要仪器
• 3. 主要试剂及配方
• 前言
• 第一部分
• 肝癌患者血清中乙型肝炎病毒MHBst的筛选
• 肝癌组织中乙型肝炎病毒MHBst的筛选
• 结论
• 第二部分
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 第三部分
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文