论文摘要
研究背景:目前研究认为角膜移植免疫排斥反应主要是T细胞介导的迟发型超敏反应,是多种免疫细胞和分子共同参与、相互调节的复杂过程。T细胞活化需要两个信号的参与,即MHC-抗原肽信号和共刺激信号。如缺乏共刺激分子提供的共刺激信号,T细胞便不能活化而处于无能状态。在T细胞活化的不同阶段,多种共刺激分子发挥着重要的调节作用。其中可诱导共刺激分子（Inducible Costimulator,ICOS）是最近发现的一种参与T细胞活化的重要共刺激分子。初步研究发现:ICOS是CD28家族成员之一,以ICOS介导的共刺激通路在多种器官移植免疫排斥中发挥重要作用,通过对该通路的干预可有效调节免疫排斥反应,并可从中探索防治免疫排斥反应的策略和手段。同种异体角膜移植是目前治疗角膜盲最为有效的方法,但移植术后排斥反应仍是导致手术失败的主要原因。不断提高角膜移植的成功率是临床亟待解决的问题。因此加强对角膜移植免疫排斥反应机理的研究,以及从多种途径积极探索良好的抗排斥反应手段具有非常重要的理论与现实意义。第一部分ICOS共刺激通路参与角膜移植免疫排斥反应的研究目的通过建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,研究ICOS共刺激通路与角膜移植急性免疫排斥反应的关系。方法取健康清洁级Wistar大鼠及SD大鼠,分为移植组和正常对照组。移植组以10只Wistar大鼠为供体,20只SD大鼠为受体,建立同种异体穿透性角膜移植模型;对照组为5只健康清洁级正常SD大鼠（10眼）。移植术后每日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片情况,并对角膜混浊、水肿、新生血管3项指标进行评分。分别于术后7天、14天取植片进行病理学观察,并采用RT-PCR法检测植片组织ICOS mRNA的表达情况,免疫组织化学法检测植片组织ICOS蛋白水平;同时采用流式细胞术检测外周血CD3+ICOS+T/CD3+T的表达情况,并以正常大鼠作对照。结果（1）术后观察:大鼠同种异体穿透性角膜移植术后7天均未发生排斥反应,术后第9天开始有大鼠植片发生排斥反应,至术后14天时角膜植片皆已发生不同程度的排斥反应。（2）HE染色结果:移植术后7天时角膜植片水肿增厚,基质纤维排列紊乱,缝线及切口周围出现大量单核细胞和淋巴细胞浸润,植片中央也可见散在的炎性细胞浸润,术后14天较术后7天更为明显。炎性细胞主要存在于上皮层和浅层基质。（3）ICOS蛋白表达情况:细胞膜、细胞浆呈棕黄色染色者为ICOS阳性细胞。正常大鼠角膜组织各层均无ICOS蛋白表达;术后7天植片上皮层、基质层出现ICOS蛋白阳性表达,主要集中在角膜前基质层;术后14天角膜植片ICOS蛋白阳性表达较7天时明显增强,阳性表达主要集中在移植床和移植片交接处,角膜前基质层较后基质层更为多见。阳性细胞评分结果:术后7天为（2.000±0.667）;术后14天为（3.700±0.483）。统计结果表明:术后14天植片ICOS蛋白阳性细胞评分高于术后7天,差异有统计学意义（t=-6.530,P=0.000）。（4）ICOS mRNA表达情况:正常大鼠角膜组织未检测到ICOS mRNA的表达;术后7天植片ICOS的PCR产物凝胶电泳条带辉度值比值为（1.168±0.190）,术后14天为（1.525±0.139）。术后14天植片ICOS的PCR产物凝胶电泳条带辉度值比值高于术后7天,差异有统计学意义（t=-4.812,P=0.000）。（5）外周血CD3+ICOS+T/CD3+T表达结果:正常大鼠外周血CD3+ICOS+T/CD3+T表达为（7.354±1.114）%,术后7天为（31.521±1.995）%,术后14天为（45.602±2.034）%。统计学处理:方差齐性（P=0.156）。与正常大鼠相比,术后7天、14天外周血CD3+ICOS+T/CD3+T表达均升高（F=2067.263,P=0.000）,且14天时较7天升高更加明显,差异有统计学意义（P=0.000）。结论（1）大鼠同种异体穿透性角膜移植术后7天植片尚未发生排斥反应,术后第9天开始有大鼠植片发生排斥反应,至14天时移植鼠植片皆发生程度不同的急性排斥反应。（2）正常大鼠角膜组织无ICOS蛋白表达,且未检出ICOS mRNA表达,与正常大鼠角膜组织各层均无淋巴细胞浸润的特征相符。（3）移植术后植片组织可检测到ICOS蛋白及mRNA的表达,且术后14天的表达高于术后7天。该结果提示共刺激分子ICOS参与了角膜移植急性免疫排斥反应的发生。（4）与正常大鼠外周血CD3+ICOS+T/CD3+T的表达相比,移植术后7天、14天外周血CD3+ICOS+T/CD3+T的表达皆升高,且14天时升高尤为明显,该结果再次提示共刺激分子ICOS与角膜移植急性免疫排斥反应关系密切。第二部分重组腺病毒Ad-EGFP转染大鼠角膜的实验研究目的评价携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP经不同转染途径原位转染大鼠角膜的可行性和安全性,探索重组腺病毒载体原位转染大鼠角膜的最佳途径。方法取健康清洁级SD大鼠80只,随机分为A、B、C、D4组,每组20只鼠。A组:近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射Ad-EGFP(滴度为2.3×1011v.p./ml)15μl;B组:近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射0.9%NaCl注射液15μl;C组:前房注射Ad-EGFP(滴度为2.3×1011v.p./ml)15μl;D组:前房注射0.9%NaCl注射液15μl。术后,每日于裂隙灯显微镜下观察角膜以及眼前段组织的变化。各组大鼠分别于注射后1天、3天、5天、7天及14天取材,每个时间点随机取4只大鼠,麻醉后处死,部分摘除术眼,石蜡包埋,切片行HE染色;部分取角膜,冰冻切片行共聚焦显微镜观察;部分角膜制备电镜标本,进行透射电镜观察角膜超微结构以及有无腺病毒颗粒存在。结果（1）术后裂隙灯显微镜观察结果:4组大鼠于注射当时及整个观察期内角膜始终保持透明,未见角膜水肿,房水清,晶状体透明。（2）HE染色结果:各组大鼠在观察期内眼前段组织（角膜、前房、虹膜等）均未见明显炎症细胞浸润和新生血管形成,亦未见明显的组织病理性改变（3）共聚焦显微镜观察GFP表达情况:0.9%NaCl注射液注射组（B、D组）角膜始终未见绿色荧光的阳性表达;Ad-EGFP各注射组（A、C组）在注射后1天角膜即可见绿色荧光,提示报告基因GFP阳性表达,随后,绿色荧光表达逐渐增强,5天时荧光表达最强,7天时荧光表达较5天时减弱,14天时更弱,但仍有一定表达;球结膜下注射Ad-EGFP组（A组）绿色荧光表达位于角膜上皮层及角膜基质层;起初主要表达于上皮层及浅层基质,至5天时表达最强,整个基质层均有表达;前房注射Ad-EGFP组（C组）绿色荧光表达仅位于角膜内皮层,整个观察期内均未见角膜上皮层及基质层有阳性表达。（4）透射电镜观察结果:0.9%NaCl注射液注射组（B、D组）大鼠角膜组织各层均未见明显超微结构改变,亦未见病毒颗粒。球结膜下注射Ad-EGFP组（A组）注射1天后,角膜上皮层及基质层胞质内均可见腺病毒颗粒,电子显微镜表现为黑色、高电子密度的颗粒集团;前房注射Ad-EGFP组（C组）注射1天后,角膜内皮层胞质内亦可见腺病毒颗粒。结论（1）携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP可通过不同途径原位转染至大鼠角膜组织。（2）球结膜下注射途径可使腺病毒携带的报告基因在角膜上皮层及角膜基质层表达;前房注射途径可使腺病毒携带的报告基因在角膜内皮层表达。通过第一部分实验可知移植术后ICOS蛋白主要表达于植片上皮层及基质层,因此以ICOS为目的基因进行干预时球结膜下注射途径优于前房注射途径。（3）携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP安全性好,在原位转染角膜组织的同时未引起明显炎症及病理学改变。第三部分重组腺病毒载体RNA干扰阻断ICOS共刺激通路抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的研究目的观察携带有报告基因GFP且表达ICOS-siRNA的重组腺病毒载体Ad-siICOS-EGFP阻断ICOS共刺激通路对角膜移植急性免疫排斥的抑制作用,探索利用RNA干扰技术阻断ICOS共刺激通路用于防治角膜移植免疫排斥反应的可行性。方法取健康清洁级Wistar大鼠（供体）及SD（受体）大鼠,建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,并且随机分为4组,每组20只鼠:单纯角膜移植对照组（A组）;Ad-siICOS-EGFP注射组（B组）,术后即刻于近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射Ad-siICOS-EGFP(滴度为3.7×1011v.p./ml)15μl;Ad-EGFP注射组（C组）,术后即刻于近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射Ad-EGFP(滴度为2.3×1011v.p./ml)15μl;生理盐水注射组（D组）,术后即刻于近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射0.9%NaCl注射液15μl。术后每日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片以及眼前段组织的变化。对角膜混浊、水肿、新生血管3项指标进行评分,观察排斥反应指数RI的变化并记录植片的存活时间。各移植组分别于术后5天随机取10只大鼠,麻醉处死后,部分角膜行免疫组织化学及RT-PCR检测;部分角膜冰冻切片行共聚焦显微镜观察。各组其余大鼠进行角膜植片存活时间统计。结果（1）各组角膜植片平均存活时间:A组（9.800±0.632）天;B组（14.700±1.418）天;C组（10.000±1.054）天;D组（10.100±0.876）天。方差齐性（P=0.306）。各组间角膜植片平均存活时间比较,差异有统计学意义（F=52.383,P=0.000）。多重比较结果:B组与其余各组相比差异均有统计学意义（P值均＜0.05）;A组、C组、D组各组间的差异均无统计学意义。B组（Ad-siICOS-EGFP注射组）角膜植片平均存活时间最长。（2）共聚焦显微镜观察GFP表达情况:球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP组（B组）及球结膜下注射Ad-EGFP组（C组）角膜植片可见绿色荧光表达,表达位于角膜上皮层及整个角膜基质层。A组、D组角膜植片未见绿色荧光表达。（3）ICOS蛋白表达情况:细胞膜、细胞浆呈棕黄色染色者为ICOS阳性细胞。各组植片均可见ICOS蛋白阳性表达,主要集中在植片的上皮层及基质层,尤以移植床和移植片交接处显著,植片前基质ICOS蛋白较后基质更为多见,B组（Ad-siICOS-EGFP注射组）ICOS蛋白阳性表达明显低于A、C、D组;各组植片组织ICOS蛋白免疫组化染色阳性细胞评分:A组（1.900±0.568）;B组（1.100±0.316）;C组（1.800±0.632）;D组（1.900±0.568）。方差齐性（P=0.368）。各组间植片组织ICOS蛋白免疫组化染色阳性细胞评分比较,差异有统计学意义（F=5.214,P=0.004）。多重比较结果:B组与其余各组相比差异均有统计学意义（P值均＜0.05）;A组、C组、D组各组间的差异均无统计学意义。B组植片组织ICOS蛋白免疫组化染色阳性细胞评分最低。（4）ICOS mRNA表达情况:各组大鼠植片组织ICOS的PCR产物凝胶电泳条带辉度值比值:A组（1.004±0.164）;B组（0.621±0.096）;C组（0.929+0.134）;D组（0.918±0.120）。统计学结果表明:方差齐性（P=0.446）。各组间植片组织ICOS的PCR产物凝胶电泳条带辉度值比值比较,差异有统计学意义（F=16.717,P=0.000）。多重比较结果:B组与其余各组相比差异均有统计学意义（P值均＜0.05）;A组、C组、D组各组间的差异均无统计学意义。B组（Ad-siICOS-EGFP注射组）植片组织ICOS的PCR产物凝胶电泳条带辉度值比值最低。结论（1）Ad-siICOS-EGFP可以有效抑制大鼠植片组织ICOSmRNA及ICOS蛋白的表达,从而阻断ICOS共刺激通路。（2）移植术后即刻受体鼠球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP,可以抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反应,延长角膜植片存活时间。
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