小麦几丁质酶基因的检测及酶活性测定

论文摘要

几丁质酶（chitinase，EC3．2．1.14）作为一种重要的病程相关蛋白，一直是植物抗菌基因工程的研究热点之一。同时几丁质酶也是一种诱导酶，多种生物和非生物因素均可诱导几丁质酶基因的表达。本文从NCBI上已经报道的小麦属几丁质酶Chi1,Chi2,Chi3,Cht2,以及Cht4五个基因序列中分析比较并用Primer软件分别设计了多对引物，对中国小麦微核心种质中随机选取的94个小麦品种和国内外的260个小麦样品材料进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，并对部分小麦品种进行测序分析；随后对260个品种中的230个样品进行小麦几丁质酶活性测定，并做了低温对照试验，分析低温对小麦几丁质酶活性的影响，最后展望了将几丁质酶基因转入到优质小麦以得到抗病体系的前景，主要结果如下：（1）在94份小麦材料中，Cht4的引物均扩增出目的片段，Chi3和Cht2也大部分扩增出目的条带，而Chi1和Chi2的第一对引物扩增出的只有37.2％，但第二对引物却大部分都扩增出了目的片段。在260个小麦品种的扩增结果中也大部分呈现这样的趋势，Cht4、Chi3和Cht2的扩增率在85％以上，而Chi1和Chi2的扩增率仍比较低。虽然每种基因的分布情况不同，但每个小麦品种中至少有一种几丁质酶基因在起作用。（2）在对8个小麦样品进行测序分析后发现，前面4个品种扩增的片段所编码的蛋白质氨基酸序列与Cht4基因的同源性最高，属于ClassⅣ几丁质酶基因；而后4个样品测出的序列与Chi3基因的同源性最高，均属于第Ⅲ类几丁质酶基因。（3）酶活性测定结果发现大部分小麦几丁质酶活性在200-600U之间，酶活性均值为421.26U，总体的酶活性比较稳定。低温处理后测定的酶活性均有不同程度的提高，大部分增高范围在0-200U之间，升高倍数在0.16％到1.199倍不等，但总体增高幅度比较小。这说明低温条件可以诱导小麦产生几丁质酶的表达，但是对酶活性的影响不明显。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 几丁质酶及其分类
• 1.2 几丁质酶的分布
• 1.3 几丁质酶特性及功能的研究
• 1.3.1 几丁质酶的特性
• 1.3.2 几丁质酶的功能研究
• 1.3.3 几丁质酶的抗病机制研究
• 1.4 几丁质酶的分子生物学研究进展
• 1.4.1 几丁质酶的分子比较研究
• 1.4.2 几丁质酶的基因结构研究
• 1.4.3 几丁质酶的分子进化研究
• 1.5 几丁质酶的应用
• 1.5.1 几丁质酶降解产物的应用研究
• 1.5.2 几丁质酶在生物防治中的应用研究
• 1.5.3 几丁质酶在抗病基因工程中的应用研究
• 1.6 几丁质酶的活性影响因素及测定研究
• 2 引言
• 3 小麦几丁质酶基因的检测
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 小麦籽粒 DNA 的提取
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 PCR 扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.4 部分小麦品种 PCR 扩增的产物回收及测序
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 几丁质酶基因在 94 个小麦品种中的分布
• 3.3.2 几丁质酶基因在 260 个小麦品种中的分布
• 3.3.3 几丁质酶基因的测序结果分析
• 3.4 讨论
• 4 小麦几丁质酶活性测定
• 4.1 材料
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 主要试剂及溶液配制
• 4.1.3 使用仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 标准曲线的绘制
• 4.2.2 胶体几丁质的制备
• 4.2.3 小麦几丁质酶的粗提
• 4.2.4 几丁质酶活性测定
• 4.2.5 低温处理及处理后酶活性测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 常温下小麦几丁质酶活性分布情况
• 4.3.2 低温处理对小麦几丁质酶活性影响情况
• 4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的学术论文
• 附表：小麦几丁质酶活性测定值