禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因VR1020和pVAX1的构建及免疫原性研究

论文摘要

本实验根据禽传染性支气管炎病毒（IBV）的四川分离株SAIBK的全基因组序列（序列登录号为:DQ288927）设计三对特异性引物,利用RT-PCR技术从SAIBk基因组中扩增出S1、M和N基因,并利用重叠延伸PCR技术对N基因进行定点突变处理。将S1、M和N基因,分别插入分泌型真核表达载体VR1020的多克隆位点,经鉴定成功构建了重组真核表达质粒VR1020-S1、VR1020-M和VR1020-N。将此三种重组质粒转染COS7细胞,用RT-PCR检测到目的基因的转录产物（mRNA）,通过间接免疫荧光实验检测到转染VR1020-S1、VR1020-M和VR1020-N的细胞孔均出现特异的绿色荧光。结果表明,构建的重组质粒能够在COS7细胞中正确转录和表达。同样设计三对特异引物,通过RT-PCR技术扩增SAIBk株的S1、M和N基因,分别导入真核表达载体pVAX1,成功构建S1、M和N基因的真核表达质粒pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N。将它们分别转染COS7细胞,用RT-PCR和间接免疫荧光实验同样检测到S1、M和N基因的转录产物（mRNA）及其表达产物。结果表明,构建的重组质粒同样能在COS7细胞中正确转录和表达。对构建的真核表达质粒pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N和VR1020-S1、VR1020-M、VR1020-N,分别以1:1:1（质量比）的比例进行混合,制备两种三基因混合DNA疫苗:（VR1020-S1+VR1020-M+VR1020-N）和（pVAX1-S1+pVAX1-M+pVAX1-N）,再分别用脂质体包被（脂质体和DNA疫苗的质量比为10:1）后,进行免疫原性实验。用间接ELISA测定特异性抗体,结果表明,（VR1020-S1+VR1020-M+VR1020-N）组和（pVAX1-S1+pVAX1-M+pVAX1-N）组免疫雏鸡均能产生特异性抗体,但前者抗体水平显著高于后者（P＜0.05）;而外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量后者高于前者（P＜0.05）;它们对强毒攻击的保护率分别为72%（13/18）和78%（14/18）。目前,以分泌型真核表达载体VR1020来构建禽传染性支气管炎病毒的DNA疫苗尚未见相关报道。用SAIBK毒株的S1、M和N基因与pVAX1载体来构建DNA疫苗,也未见报道。本实验也证实了VR1020（胞外表达载体）和pVAX1（胞内表达载体）用作作家禽DNA疫苗载体的可行性,但前者主要诱发体液免疫反应,后者则主要诱发细胞免疫反应。本研究为禽传染性支气管炎（IB）的深入研究提供了重要的科学依据,为IB的临床防治提供了基础材料。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 禽传染性支气管炎研究进展
• 1.1.1 禽传染性支气管炎的危害
• 1.1.2 禽传染性支气管炎的流行与分布
• 1.2 禽传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展
• 1.2.1 禽传染性支气管炎病毒的基因组结构
• 1.2.2 禽传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白
• 1.3 禽传染性支气管炎病毒核酸疫苗研究进展
• 1.4 真核表达载体VR1020和pVAX1的研究和应用概况
• 1.5 本研究的前期工作基础
• 1.6 存在的问题
• 1.7 本研究的目的意义和创新点
• 2.禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达载体VR1020的构建与鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体、模板、基因工程菌及细胞株
• 2.1.2 主要生化试剂
• 2.1.3 培养基和主要溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器设备与实验耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 S1、M、N基因的RT-PCR扩增
• 2.2.3 N基因的定点突变处理
• 2.2.4 S1、M、N基因VR1020真核表达质粒的构建
• 2.2.5 S1、M、N基因VR1020重组质粒的鉴定
• 2.2.6 真核表达质粒的表达检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 S1、M、N基因的RT-PCR扩增结果
• 2.3.2 N基因的定点突变结果
• 2.3.3 S1、M、N基因VR1020重组质粒的鉴定
• 2.3.4 真核表达质粒的表达检测结果
• 3.禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达载体pVAX1的构建与鉴定
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 技术路线
• 3.2.2 S1、M、N基因的RT-PCR扩增
• 3.2.3 S1、M、N基因pVAX1真核表达质粒的构建
• 3.2.4 S1、S1、M、N基因pVAX1重组质粒的鉴定
• 3.2.5 真核表达质粒的表达检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 S1、M、N基因的RT-PCR扩增结果
• 3.3.2 S1、M、N基因pVAX1重组质粒的鉴定
• 3.3.3 真核表达质粒的表达检测结果
• 4.禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因DNA疫苗的制备与免疫原性研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 质粒、攻毒用毒株、实验动物
• 4.1.2 主要生化试剂
• 4.1.3 主要的配制试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 质粒的大量制备与检测
• 4.2.2 脂质体的制备
• 4.2.3 DNA疫苗的配制
• 4.2.4 实验动物分组及免疫
• 4.2.5 特异性IBV血清抗体的检测
• 4+、CD₈+T淋巴细胞亚类检测'>4.2.6 CD₄+、CD₈+T淋巴细胞亚类检测
• 4.2.7 攻毒实验
• 4.3 结果
• 4.3.1 质粒的大量制备与检测结果
• 4.3.2 脂质体及疫苗的制备结果
• 4.3.3 特异性IBV血清抗体的检测结果
• 4+、CD₈+T淋巴细胞亚类检测结果'>4.3.4 CD₄+、CD₈+T淋巴细胞亚类检测结果
• 4.3.5 攻毒实验结果
• 5.讨论
• 5.1 目的基因的选择
• 5.2 载体的选择
• 5.3 真核表达质粒的转染
• 5.4 真核表达质粒表达产物的检测
• 5.5 IBV DNA疫苗组合
• 5.6 关于真核表达载体VR1020和pVAX1的比较
• 5.7 脂质体的佐剂作用
• 5.8 关于DNA疫苗的免疫原性
• 5.9 攻毒保护实验
• 6.结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1:英汉缩略名词对照表
• 附录2:N基因定点突变后的测序结果
• 攻读硕士学位期间发表的论文