论文摘要
哺乳动物精子发生是一个极其复杂的、且受到严格调控的细胞分化过程,可以分为三个时期:有丝分裂期、减数分裂期和精子形成期。在这一过程中,精原细胞逐渐转化成高度分化的单倍体精子,成熟的精子释放到曲细精管管腔。曲细精管中唯一的体细胞——Sertoli细胞,和发育中的各级生精细胞始终通过细胞间的直接接触和/或旁分泌信号途径进行着物质和信息的交流,且Sertoli细胞的结构和功能随生精周期发生着明显的周期性波动,但是,Sertoli细胞调节精子发生的分子基础仍不是很清楚。基因敲除技术的出现,为这一领域的探究提供了新的工具。Tyro3受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases,RTKs）亚家族包括三个成员:Axl、Tyro3和Mer。虽然以前已有研究证实Tyro3 RTKs三个基因同时敲除的雄性小鼠不育,但其机理未明。鉴于此,我们利用Tyro3 RTKs基因敲除小鼠为模型,深入研究了Tyro3 RTKs在调节精子发生中的功能,研究结果为阐明Tyro3 RTKs调节精子发生的机理提供了初步的实验依据。我们对不同基因型雄性Tyro3 RTKs基因敲除小鼠的生育能力进行了观察。与正常雌性小鼠的交配实验表明:单基因敲除小鼠（A、M和T）生育能力与正常相仿;双基因敲除小鼠生育能力因所敲除的基因不同而异,AT型敲除小鼠的生育能力正常,但AM和MT型小鼠的生育能力均较正常明显下降。三基因敲除的杂合体小鼠生育能力进一步下降,以aMT型与AMt型小鼠最为明显。三基因同时敲除的TAM型小鼠完全丧失了生育能力。而且,各种基因型小鼠睾丸重量/体重比值和附睾精子计数的结果显示与其生育能力吻合。生育能力低下的基因型小鼠睾丸重量/体重比值下降,附睾精子数量减少,反之亦然。TAM型小鼠睾丸重量/体重比值降为正常的30%,附睾内完全缺失成熟精子,出现大量未成熟精子。这些结果提示Tyro3 RTKs亚家族的成员之间在调节精子发生上存在相互协调,Mer可能起到更重要的作用。利用半薄切片技术,我们详细观察了TAM雄性小鼠生后发育阶段（3天、1周、2周、3周、5周、8周和15周）睾丸的形态学变化,并对前3周睾丸内精原细胞、初级精母细胞、精子细胞、支持细胞、肌样细胞和退化的细胞进行了计数。我们发现TAM小鼠精原细胞、支持细胞和肌样细胞的数量没有改变。但自2周开始,睾丸出现早期退化现象,初级精母细胞数量较正常下降,退化细胞增多,3周时改变更加明显,而且圆形精子细胞数量也减少。这些退化现象随年龄增长而不断加剧。5周曲细精管上皮中长形精子细胞数量明显减少,而退化细胞显著增多,Sertoli细胞胞质中出现空泡;8周曲细精管中已少见长形精子细胞,且不同成熟阶段的精子细胞同时出现于同一个曲细精管横切面上,提示精子发生的不同步;同时可见部分残余体脱落到管腔中。15周小鼠已基本无长形精子;Sertoli细胞空泡化、精子细胞发育不同步、发育各个阶段的生精细胞脱落及合胞体形成的现象更加明显;偶尔可见少量仅剩下Sertoli细胞和精原细胞的曲细精管。应用流式细胞术对小鼠睾丸内细胞进行了核型分析,与形态学观察的结果完全一致,TAM小鼠浓缩的单倍体核显著减少刚好对应了长形精子的严重缺失。这些表型清楚地反映了Sertoli细胞和生精细胞之间的连接出现异常,提示Tyro3 RTKs可能参与介导Sertoli细胞与生精细胞之间的黏附功能。这个假说也得到了体外实验的证实,体外培养的3周TAM小鼠Sertoli细胞与生精细胞的黏附能力显著下降。本文对睾丸内脂滴进行了分析。脂滴是Sertoli细胞胞质中的一种重要的内含物,其确切的功能和代谢情况目前仍不是很清楚。我们采用了冰冻切片油红O染色、结合Image-Pro Plus图像分析系统进行显微定量分析,详细观察了生后发育阶段到成年后小鼠睾丸中脂滴的动态变化规律。结果发现,Sertoli细胞内脂滴的量随小鼠性成熟而逐渐增加,与生精细胞的发育进展呈现正相关,生精细胞越多,脂滴的量就越高。而且成年后小鼠睾丸曲细精管内的脂滴可以分为两个部分,分别位于基底部的Sertoli细胞内和管腔部的精子细胞细胞质叶（残余体）中,二者的量均有与生精周期相伴的周期性改变。前者Ⅸ—Ⅰ期水平较高,后者Ⅶ—Ⅷ期水平较高。并且,无论是青春期还是成年后,Sertoli细胞内脂滴的量始终与其吞噬的曲细精管内凋亡生精细胞以及残余体的量呈现非常紧密的时空相关性,提示其可以作为评价Sertoli细胞吞噬功能的指标。这一推测也得到了体外吞噬实验的证实,与凋亡生精细胞共培养后,Sertoli细胞内脂滴的量明显增加。另外,我们还分离了各期的曲细精管,利用荧光素/荧光素酶反应体系和血小板分析仪,检测了各期曲细精管内ATP的含量,同时利用酶组化法检测了ATP酶的含量。我们发现各期曲细精管内ATP的含量与该期Sertoli细胞内脂滴的量成正相关,与ATP酶的量成负相关。这些结果提示Sertoli细胞内的脂滴可用作产生能量的原料,为精子发生提供能量。Sertoli细胞中的脂代谢仍然值得进一步的研究。最后,我们观察了TAM小鼠生后发育阶段到成年后睾丸内脂滴的动态变化规律。与同年龄正常小鼠相比较,TAM小鼠Leydig细胞的脂滴含量无明显改变,曲细精管内的脂滴却有明显改变。TAM Sertoli细胞内的脂滴2周时开始下降,且随年龄增长而降低更加明显;而且,其脂滴的含量与生精上皮的完整性成正比,破坏越严重的曲细精管,其内的脂滴含量越少,反之亦然;而且脂滴含量丧失了正常的周期性变化规律,15周TAM小鼠Sertoli细胞内脂滴含量仅为正常的13%。鉴于Sertoli细胞内脂滴的量可以作为评价Sertoli细胞吞噬功能的指标,这些结果提示TAM小鼠Sertoli细胞的吞噬功能受损。体外吞噬实验的结果也证实了这一推论。我们还发现TAM小鼠曲细精管中ATP的量也降低,同时ATP酶的量增加,这与我们的推论完全一致。TAM小鼠Sertoli细胞的吞噬能力降低,导致脂滴形成减少,水解产生的ATP也随之减少,为缓解能量供应的不足,ATP酶代偿性的增多。结论:Sertoli细胞可能是Tyro3 RTKs的直接作用靶点。Tyro3 RTKs可能调节Sertoli细胞与生精细胞之间的黏附以及Sertoli细胞的吞噬功能,进而调节精子发生。TAM小鼠可能是研究Sertoli细胞调节精子发生机理的有用模型。