双黄连、鱼腥草、大蒜新素注射液抗鼠冠状病毒MHV-3效应的体内外实验研究

论文摘要

【研究背景】两年前,一场令世人震惊的“非典”——严重急性呼吸综合征（SARS）疫情肆虐中华大地,因其病因不明,传染性极强,后果严重,缺乏有效控制疫情和治疗手段,曾一度造成世界范围的恐慌。经过整个医学界的通力合作,基本认定“SARS”的病原就是来自其他物种的冠状病毒变异株。此后,有关SARS病毒的病毒学、流行病学、致病机制、诊断、治疗、预防与控制等方面的研究成为我国,乃至世界范围的重点和热点问题。在抗SARS冠状病毒（SARS-CoV）的小分子化合物和疫苗尚未面市之前,在已经注册上市的抗病毒药物中寻找对SARA-CoV有效的药物不失为一条捷径,一旦发现有效抗SARA-CoV药物,即可直接应用于临床。中药是祖国医学的宝库,多年来,国内外科学家对中药进行了大量的研究,归纳出具有抗病毒作用的中药达189种,具有免疫调节作用的中药有273种。中药在治疗病毒感染性疾病上应用广泛,其效果独特,毒副作用小,药源丰富,价格低廉,能调节机体免疫功能,抑制病毒复制,阻止病毒致细胞病变等特点已经显示出其优势。【目的】选择与SARS-CoV同源性较高的小鼠冠状病毒（鼠肝炎病毒3型,MHV-3）建立能够体外观察药物抗病毒效应的感染细胞模型和暴发型肝炎小鼠模型,在细胞水平和动物水平研究中药制剂——大蒜新素、双黄莲、鱼腥草注射液对MHV-3的抗病毒效应与作用环节以及整体预防和治疗作用,为研制开发临床治疗SARS-CoV感染的中药制剂提线索和实验依据。【方法】1.三种中药注射液抗MHV-3病毒效应的体外研究1.1建立MHV-3感染细胞模型:利用病毒蚀斑试验确定适宜病毒感染复数（MOI）,建立MHV-3感染细胞模型;1.2建立药物干预模型:用MTT法确定小鼠L2细胞系对大蒜新素、双黄莲、鱼腥草注射液的最大耐受浓度（MTC）和半数细胞毒浓度（TC50）。用蚀斑抑制实验测定各中药抗MHV-3的半数抑制浓度（IC50）。在MTC和IC50基础上设定药物浓度梯度,并观察药物抗MHV-3活性及其量效关系;1.3药物抗病毒效应及作用环节研究:设立不同给药时间和条件,研究药物抑制病毒的作用环节。三种中药注射液（以MTC浓度为起点等倍稀释,设定大中小剂量）分别设立实验分组:①感染细胞对照组;②预防组:药物预处理细胞6h,去除药物后接种病毒;③中和组:药物与病毒同时加入细胞,病毒吸附完成后去除药物;④治疗组病毒吸附后加入含药培养基。各组以病毒吸附后加入含药或不含药培养基开始计时,12h后同时收获细胞和培养上清,反复冻融后取离心上清0.1ml,用蚀斑形成法半定量评估各组病毒量变化,并进行比较分析。2.三种中药注射液抗MHV-3病毒效应的整体研究2.1经腹腔注射MHV-3（100PFU/只）感染8周龄BALB/c小鼠,建立暴发型病毒性肝炎动物模型;2.2用药方案及实验分组:根据人体中效剂量计算出动物给药剂量,分别为大蒜新素75mg/kg、双黄莲750mg/kg、鱼腥草20 mg/kg,分别设定下列实验分组:①感染模型对照组;②治疗组:腹腔感染MHV-3病毒30min后,腹腔给药0.1ml,1次/天,疗程最长7天;③预防组:腹腔注射药物0.1ml,1次/天,连续3天后停药,立即腹腔注射MHV-3病毒,不再用药,观察7天;④预防+治疗组:先按预防组方案用药3天,然后腹腔注射MHV-3病毒,并继续腹腔给药,最长7天（总用药疗程最长10天）。每种药物的每个实验组设小鼠18只,随机入组,各组在感染后72h各随机处死6只活鼠,留取全血和肝组织样本待检。2.2观察指标:①小鼠存活时间;②血浆ALT;③肝组织内病毒滴度（蚀斑形成法）:病毒含量用蚀斑均数/mg肝组织±标准差（SD）表示;④肝脏病理改变:采用Rezkalla半定量分析,计算平均每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野面积之比,无病变计0分,<25%计1分,25%～50%计2分,50%～75%计3分,>75%计4分。2.3统计学处理:采用SPSS12.0软件包进行小鼠生存分析和比较;采用方差分析和t检验比较各组间血浆ALT、肝组织病理评分和病毒蚀斑数的差异。【结果】1三种中药注射液抗MHV-3病毒效应的体外研究1.1建立细胞感染模型的理想病毒接种量为低MOI（MOI=0.0001）,在此种条件下建立的感染性细胞模型在病毒接种24h后进行蚀斑抑制试验时方可观察到满意的效果。1.2 L2细胞对药物的最大耐受浓度（MTC）分别为:大蒜新素7.6μg/ml;双黄连1000μg/ml;鱼腥草51.29μg/ml。药物对细胞的半数细胞毒浓度（TC50）分别为:大蒜新素75μg/ml,双黄莲6100μg/ml,鱼腥草500μg/ml。药物抑制MHV-3的半数有效浓度（IC50）分别为:大蒜新素2.7μg/ml;双黄连304.9μg/ml;鱼腥草22.06μg/ml。故治疗指数（TI=TC50/IC50）分别为:大蒜新素27.78,双黄连20.07,鱼腥草22.67。1.3大蒜新素的抑制病毒效应大、中、小剂量大蒜新素的病毒蚀斑抑制率分别为:预防组:56.87%、39.22%、25.49%;中和组:60.40%、48.51%、36.63%;治疗组:69.70%、57.58%、45.45%,三组药物剂量与抑制效应呈正相关（预防组r=0.9896;中和组r=0.9906;治疗组r=0.9931）。三组蚀斑抑制率比较,治疗组最高,中和组其次,预防组最低。1.4双黄连的抑制病毒效应大、中、小剂量双黄连的病毒蚀斑抑制率分别为:预防组:65.87%、53.15%、38.79%;中和组:69.42%、57.52%、42.53%;治疗组:73.77%、62.50%、48.08%。三组药物剂量与抑制效应呈正相关（预防组:r=0.9948;中和组:r=0.9936;治疗组r=0.9916）。三组抑制率比较,治疗组最高,中和组其次,预防组最低。1.5鱼腥草的抑制病毒效应大、中、小剂量鱼腥草的病毒蚀斑抑制率分别为:预防组:61.76%、50.00%、29.41%;中和组:65.34%、51.49%、32.67%;治疗组:70.53%、54.55%、35.79%。三组药物剂量与抑制效果呈正相关（治疗组r=0.9967;中和组:r=0.9980;治疗组:r=0.9935）。三组抑制率比较,治疗组最高,中和组其次,预防组最低。2三种中药注射液抗MHV-3病毒效应的整体研究2.1小鼠成活时间2.1.1大蒜新素处理组:治疗组、预防组和预防+治疗组5天内死亡数分别为12只、5只和3只。经统计学生存分析,治疗组与模型组无明显差异（P>0.05）,预防组和预防+治疗组与模型组和治疗组比较差异明显（P<0.05）,预防组与预防+治疗组之间比较无明显差异（P>0.05）。2.1.2双黄连处理组:治疗组、预防组和预防+治疗组5天内死亡数分别为8只、5只和4只,三组与模型组比较均有明显差异（P<0.05）;预防+治疗组与预防组比较无明显差异（P>0.05）,但与治疗组比较差异明显（P<0.05）。2.1.3鱼腥草处理组:治疗组、预防组和预防+治疗组5天内死亡数分别为9只、5只和5只,三组与模型组比较均有明显差异（P<0.05）;预防+治疗组与预防组比较无明显差异（P>0.05）,但二组与治疗组比较均差异明显（P<0.05）。2.2血浆ALT水平变化模型组血浆ALT显著升高,达5573.79±320.52 U/L,各药物处理组ALT均明显低于模型组（P<0.01）,但仍呈高水平,达2716.21±520.01 U/L至4453.12±402.66 U/L之间。三组比较,三种药物的预防组和预防+治疗组ALT水平都还明显低于相应治疗组（P<0.01）。2.3肝组织病毒滴度变化肝组织病毒滴度:模型组为6.07±0.25 PFU/mg;大蒜新素治疗组、预防组、预防+治疗组分别为4.53±0.55 PFU/mg、4.2±0.6 PFU/mg和3.7±0.44 PFU/mg;双黄连治疗组、预防组、预防+治疗组分别为3.77±0.31 PFU/mg、3.63±0.15 PFU/mg、2.67±0.59 PFU/mg;鱼腥草治疗组、预防组、预防+治疗组分别为3.73±0.21 PFU/mg、3.43±0.25 PFU/mg、3.10±0.36 PFU/mg。三种药物各用药组与模型组比较都有明显差异（P<0.05）。但三组间比较,仅见双黄连预防+治疗组肝病毒滴度明显低于其治疗组和预防组（P<0.05）。2.4肝组织形态学变化模型鼠肉眼见肝体积明显肿大,呈酱紫色;光镜下肝结构严重破坏,大片肝细胞破坏,小叶结构紊乱,肝索消失,肝窦内见出血并有血栓形成,肝细胞坏死区见单核细胞和中性粒细胞浸润。各药物处理组中以大蒜新素治疗组病变最为严重,其他各组肝体积较模型组小,色泽暗红,光镜下肝细胞坏死面积和炎性细胞浸润量较模型组小,小叶结构无明显紊乱,仍见大量点片状肝细胞坏死,肝窦内无血栓形成。肝组织病理指数比较,双黄连治疗组和预防+治疗组的肝病变指数明显低于模型组,其余各组肝病变指数虽有所下降,但与模型鼠比较无差异。【结论】1.成功建立小鼠冠状病毒细胞感染模型,为冠状病毒感染治疗药物筛选和疾病发病机制研究提供了一个良好的体外研究平台。2.在体外细胞模型,大蒜新素、双黄连、鱼腥草都具有明显抗鼠冠状病毒MHV-3作用,其抑制效应呈剂量依耐性,可能涉及病毒吸附和穿入以及细胞内增殖等多个环节。大蒜新素治疗指数最高;鱼腥草其次;双黄连最低。3.在MHV-3暴发型肝炎模型,大蒜新素、双黄连、鱼腥草都具有明显直接抗MHV-3效应,能明显降低模型鼠肝组织病毒载量,双黄连的整体抗MHV-3作用最强;大蒜新素、双黄连和鱼腥草预防性用药可明显改善模型鼠的预后,有意义地延长模型鼠生存时间和减轻肝功能损害,提示这些药物的预防效应优于其治疗作用,可能作为冠状病毒流行期间人群预防的候选药物。

论文目录

• 论文一
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文部分
• 前言
• 第一部分：三种中药注射液抗 MHV-3 病毒效应的体外研究
• 一 MHV-3 感染细胞模型的建立
• 材料和方法
• 结果
• 50)的测定'>二 L2 细胞对大蒜新素注射液最大耐受浓度（MTC）及药物对 MHV-3 病毒半数抑制浓度(IC₅₀)的测定
• 材料和方法
• 结果
• 50)的测定'>三 L2 细胞对双黄连注射液最大耐受浓度（MTC）及药物对 MHV-3 半数抑制浓度(IC₅₀)的测定
• 材料和方法
• 结果
• 50)的测定'>四 L2 细胞对鱼腥草注射液最大耐受浓度（MTC）及药物对 MHV-3 半数抑制浓度(IC₅₀)的测定
• 材料和方法
• 结果
• 五 大蒜新素、双黄连、鱼腥草注射液抗 MHV-3 活性的体外研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分：大蒜新素、双黄连、鱼腥草注射液治疗小鼠 MHV-3 性暴发型肝炎模型的整体研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 论文二
• 摘要
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 附录1
• 附录2
• 致谢