论文摘要
肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSC）学说认为肿瘤中的亚群-肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的源泉,是肿瘤复发、浸润、转移的根源。寻找肿瘤干细胞的特异性表面标志物、研究肿瘤干细胞的生物学性质进而深入探讨肿瘤干细胞在肿瘤发生发展机制中的作用是证明肿瘤干细胞学说的关键。目前,在乳腺癌、肺癌、结肠癌等实体瘤中已成功分离出相应的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的培养、分离及生物学性质的鉴定一直是制约肿瘤干细胞研究的瓶颈。目前分选肿瘤干细胞的方法主要有利用其特异性表面抗原标志检测的免疫磁珠活性细胞分选法以及利用流式细胞仪活性细胞分选侧群细胞（side population, SP）的分选方法。近年来Hemmati和Singh等利用添加多种生长因子的无血清培养基从脑胶质瘤及髓母细胞瘤等脑肿瘤中分选并培养出脑肿瘤干细胞球,并通过实验证明其为脑肿瘤干细胞,在肿瘤干细胞的分离培养方面取得了突破性进展。本实验的目的是将无血清悬浮的培养方法应用于人舌鳞癌细胞系Tca8113的培养,以期从中分离出人舌鳞癌干细胞相关亚群,观察其增殖和成瘤的特性,并与流式细胞仪分选出的侧群细胞进行生物学特性进行比较。研究方法及结果:1.人舌癌细胞株Tca8113细胞无血清的培养方法:细胞系为人舌鳞癌细胞系Tca8113.含血清培养基,为含10﹪小牛血清的RPMI 1640培养基或称之为传统的普通培养基（serum supplemented medium,SSM）。无血清培养基（SFM）为DMEM/F12（1:1）中添加5U/L胰岛素、20U/L EGF和10U/L bEGF等生长因子。细胞系的培养Tca8113细胞系在含10﹪小牛血清的RPMI 1640培养基中置37℃、5﹪CO2培养箱内培养。用0.25﹪胰蛋白酶和0.02﹪EDTA的消化液消化传代细胞。选用对数生长期细胞进行实验。肿瘤干细胞相关亚群的分离培养和传代选择对数生长期的细胞系Tca8113,用PBS液清洗,胰蛋白酶消化,重悬于SFM培养基接种于培养瓶中（1:1接种）,继续在37℃、5﹪CO2培养箱内培养.待增殖形成细胞球3-4d后,将收集于离心管中,自然沉降20min弃去半量陈旧上清液,加入等量新鲜SFM并机械吹打呈单细胞悬液,重悬于SFM,按1:2的比例传代。肿瘤干细胞相关亚群交替在SSM和SFM培养基中培养按照1.2.3的方法,待SP细胞在SFM中形成细胞球2d后。收集并重悬于SSM液中,待其呈单层细胞生长后,再收集并重悬于SFM液中,呈细胞球样悬浮生长。结果:普通培养基中Tca8113呈贴壁生长,部分细胞凋亡呈悬浮状态。普通培养基中处于生长期的Tca8113细胞移植于无血清培养基中,24-48h小时后,部分细胞聚集呈球状,而大部分细胞呈悬浮状。3-5天后无血清培养基中的细胞球增多,体积变大,更加紧密。2.人舌癌细胞株Tca8113中SP细胞群的分离方法:细胞分别取SSM中的贴壁细胞和收集到的SFM呈球样的悬浮细胞,制成单细胞悬液,调整细胞密度为106/ml,加入Hoechst33342（终浓度为5μg/ml）,37℃水浴90min,每20min震荡混匀1次,最后低温离心机离心10min弃上清液,用4℃PBS洗2遍。重悬于4℃含1﹪胎牛血清的PBS中。FACS流式细胞仪紫色激光检测细胞系中SP细胞比例。此实验重复5次。其中SSM分选到的侧群细胞标记为SP细胞,SFM分选得到的侧群细胞标记为TSC-SP细胞。碘化丙啶（PI）标记死细胞。流式细胞仪检测分选,发光偏弱的即为SP细胞。去除PI阳性死细胞,收集分选出来的SP细胞。结果: Tca8113细胞系中SP数量较少,约为0.2﹪。而在无血清悬浮培养中的TSC-SP细胞的数量约为0.4﹪。3.人舌癌细胞株Tca8113细胞中SP细胞生物学特性的鉴定方法:平板克隆形成试验取对数生长期的SP和TSC-SP单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度（根据增殖能力）接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,每组各20个集落,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃5% CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2～3周。经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL,固定15分钟。然后去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,在显微镜下观察。体外成瘤实验分别取处于对数生长期的SP和TSC-SP细胞,计数活细胞,以103,104,105,106浓度将细胞注射于实验小鼠（裸鼠）的背部皮肤黏膜下,每组2只小鼠。每4天观察肿瘤的生长情况（0-8周）并记录肿瘤的直径。结果表明:TSC-SP与SP细胞的平板克隆形成实验在平板克隆实验中,TSC-SP细胞与SP细胞均具有较强的克隆形成能力（均为60个克隆株,均形成克隆集落,克隆形成率均为100%）。取相同数量细胞的平板克隆培养板,显微镜下观察均发现SP细胞所形成的克隆细胞数量较少,体积较小,而TSC-SP细胞所形成的克隆细胞数量较多,体积较大。体外成瘤实验的结果在相同条件下（观察时间0-8周）,103数量级的TSC-SP和SP细胞接种的裸鼠背部的皮肤黏膜,均未成瘤。接种16天后,105和106数量级的TSC-SP和SP接种裸鼠背部皮肤黏膜均出现瘤体,而24天后104才开始出现瘤体。但SP细胞所形成的移植瘤在相同条件下,直径均小于TSC-SP细胞所形成的移植瘤。研究结果表明:人舌鳞癌细胞系Tca8113中含极少量的SP细胞,利用无血清培养基可以达到富集肿瘤干细胞亚群的目的。总之,作者利用无血清培养基成功的分离并富集了肿瘤干细胞样细胞。通过比较无血清培养基悬浮法培养分离的侧群细胞与流式细胞仪所分选的侧群细胞的生物学特性,证明悬浮法分离的侧群细胞可以满足我们课题的需要,这将是我们下一步研究的重点之一。