海绵放线菌抑菌活性菌株的筛选及HVG 29菌株代谢产物的分离与结构鉴定

论文摘要

海洋放线菌在苛刻的海洋环境下的进化过程,造就了其复杂而独特的代谢途径,其次级代谢产物在结构类型及生物活性方面都呈现出与陆生放线菌不同的特点和多样性。开发海洋放线菌资源,寻找新型药物活性先导化合物已成为当前的研究热点。海绵是最原始的多细胞动物,滤食性的摄食方式使其体内富集了大量微生物,’其中也包括大量海洋放线菌,因此海绵成为海洋放线菌的一个重要来源。本文以来自大连海域的繁茂膜海绵、肾指海绵以及来自南海海域的澳大利亚厚皮海绵、细薄星芒海绵、多皱软海绵、南海小轴海绵中分离出的101株海绵放线菌为研究对象,以三株农业致病菌胡萝卜软腐欧文氏菌、野油菜黄单孢菌及水稻黄单胞菌为筛选模型,对菌株进行活性筛选,发现约有40%的菌株具有不同程度的抑菌活性。其中28株菌对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑制作用,29株菌对野油菜黄单孢菌表现出抑菌活性,32株菌对水稻黄单胞菌具有抑制作用；有30株菌同时对一种以上的致病菌具有抑菌活性,其中有19株菌同时对三种致病菌具有抑菌活性,分别占供测菌株的30%和19%。选择其中活性最好的HVG 29菌株,运用16S rDNA序列分析方法进行种属鉴定,菌种的鉴定的结果为HVG 29属于链霉菌属。将Streptomyces sp. HVG 29进行了大规模液体发酵,三批发酵获得发酵液约45 L,对发酵液上清和菌丝体沉淀分别进行提取,共得到HVG 29菌株的代谢产物粗提物约17g。将粗提物应用硅胶柱层析、薄层层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备薄层层析等方法进行分离纯化,最后得到3种单体化合物：HVG 29-1（7.8 mg）、HVG 29-2（5.3 mg）、HVG 29-5（5.9mg）。运用EI-MS、HRESI-MS、1H NMR、13C NMR、DEPT、H-H COSY、HSQC、HMBC等光谱学方法,对三种单体化合物的结构进行了鉴定：HVG 29-1、HVG 29-2、HVG 29-5三种化合物均属于核苷类化合物,其中HVG 29-1与HVG 29-5为已知化合物,分别为3-甲基胸苷（3-Methylthymidine）与3-甲基-3’-脱氧尿苷（3-methyl-3’-deoxyuridine）, HVG 29-2为3-乙酰基胸苷（3-acetylthymidine）,目前未见报道,为新化合物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 海洋放线菌的种类
• 1.2 海洋放线菌次级代谢产物及其活性研究
• 1.2.1 生物碱类
• 1.2.2 萜类
• 1.2.3 醌类
• 1.2.4 大环内酯类
• 1.2.5 聚酮类
• 1.2.6 肽类
• 1.3 海绵与海洋放线菌的关系
• 1.3.1 海绵的结构
• 1.3.2 海绵的生物活性与海洋微生物的关系
• 1.4 本论文的研究意义及内容
• 1.4.1 本论文的研究意义
• 1.4.2 本论文的研究内容
• 2 海绵放线菌抑菌活性的筛选及菌种鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 致病菌培养
• 2.2.2 放线菌菌种活化
• 2.2.3 放线菌菌株发酵
• 2.2.4 放线菌的抑菌活性筛选
• 2.2.5 放线菌菌种鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 放线菌的抑菌活性筛选结果
• 2.3.2 放线菌菌种鉴定结果
• 2.4 小结
• 3 HVG 29菌株代谢产物的提取与分离纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 HVG 29菌株的批量发酵
• 3.2.2 HVG-29菌株代谢产物提取
• 3.2.3 粗提物的分离纯化
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 HVG-29菌株批量发酵结果
• 3.3.2 发酵液上清中代谢产物的提取结果
• 3.3.3 菌丝体中代谢产物的提取结果
• 3.3.4 粗提物TLC检测结果
• 3.3.5 粗提物的分离纯化结果
• 3.4 小结与讨论
• 4 单体化合物的结构鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 HVG 29-5的结构鉴定结果
• 4.3.2 HVG 29-1的结构鉴定结果
• 4.3.3 HVG 29-2的结构鉴定结果
• 4.4 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录A 部分试剂的配制方法
• 附录B 质谱及核磁共振谱图
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢