海绵共栖细菌NJ6-3-1基于群体感应调控抗菌物质代谢的研究

论文摘要

本文从开发海洋药物及探询药源问题出发,针对海洋抗生素类天然产物的药源生物―海洋共栖微生物,探讨其基于群体感应调控抗菌活性物质代谢的机制,以期了解海洋微生物产生天然产物的生物源头。通过在不同海洋环境中广泛采样,分离海洋细菌,提取其代谢产物,以抗菌、细胞毒作为筛选模型研究了它们的活性,结果发现一株海绵共栖细菌Pseudoalteromonas piscicida NJ6-3-1因其具有显著的抗菌和细胞毒活性受到关注。本研究以细菌NJ6-3-1为个案,研究了该菌在不同生长条件下代谢产物的抗菌活性与细胞密度的关系,结果发现其代谢抗菌物质的行为与细胞密度密切相关,只有当细胞密度达到一定的阈值OD630=0.4时,NJ6-3-1才能代谢抗菌物质。通过模拟自然的竞争环境,研究了低密度条件下的细菌NJ6-3-1与外源细菌Staphylococcus aureus共培养时的抗菌活性,结果发现外源病原菌S. aureus代谢产物中存在某种信号分子,能诱导NJ6-3-1在不产生抗菌物质的生长条件下代谢抗菌物质。利用细菌NJ6-3-1自身代谢产物的3种缩二肽（diketopiperazines,DKPs）作为自诱导物质（AI）,研究了低密度条件下的细菌NJ6-3-1与3种不同DKPs共培养时的抗菌活性情况。结果发现了1种DKPs即cyclo（L-Phe-L-Val）,能诱导NJ6-3-1在不产生抗菌物质的生长条件下代谢抗菌物质。以上结果初步说明NJ6-3-1具有群体感应系统,且其抗菌活性受到种内和种间群体感应系统的调控。对细菌NJ6-3-1进行30L摇瓶培养,其抗菌物质通过化学手段分离纯化、NMR及质谱表征,结果表明受群体感应调控的抗菌物质为邻苯二甲酸异辛酯。本文从海洋生物附生细菌的分离开始、进行了代谢产物生物活性筛选、细菌分子鉴定,研究了海洋细菌活性产物的代谢并鉴定了代谢化合物的结构,最后对细菌基于群体感应调控抗菌产物的代谢进行了研究,这项工作不仅完善了一套进行海洋微生物活性天然产物研究的系统方法,为开发具有药用潜力的天然化合物建立模型,也为海洋微生物作为海洋活性物质的药源提供新的依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 细菌群体感应现象的研究历史
• 2 细菌群体感应信息系统
• 2.1 细菌种内特异性的群体感应信息系统
• 2.1.1 革兰氏阳性细菌中寡肽介导的信息系统
• 2.1.2 革兰氏阴性细菌中AHL-LuxI／LuxR 介导的信息系统
• 2.2 细菌种间LuxS/AI-2 介导的群体感应信息系统
• 3 细菌群体感应系统的形成及调节机制
• 3.1 细菌群体感应系统的形成机制
• 3.2 细菌群体感应系统的调节机制
• 3.3 细菌群体感应机制的用途
• 4 海洋微生物中的群体感应现象
• 第二章 海洋细菌的分离、活性筛选及其鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 样品处理
• 1.3 分离细菌
• 1.4 菌株培养液粗提取物制备
• 1.5 抗菌活性筛选
• 1.6 细胞毒筛选
• 1.7 细菌鉴定
• 1.7.1 DNA 的提取（DNA 提取试剂盒）
• 1.7.2 引物
• 1.7.3 PCR 反应
• 1.7.4 序列分析和系统发生学地位的确定
• 2 结果与讨论
• 2.1 海洋细菌的抗菌活性
• 2.2 海洋细菌的细胞毒活性
• 2.3 具有显著生物活性细菌的分子生物学鉴定
• 3 结论
• 第三章 海绵共栖细菌 NJ6-3-1 基于群体感应调控的抗菌活性
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 实验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗菌活性的密度依赖实验
• 1.2.2 外源细菌诱导NJ6-3-1 产生抗菌活性实验
• 1.2.3 不同外源诱导物的获得
• 1.2.4 外源诱导物质的添加
• 1.2.5 海洋细菌代谢产物的提取
• 1.2.6 代谢产物抗菌活性的检测
• 2 结果
• 2.1 不同培养条件下细菌NJ6-3-1 的生长
• 2.2 不同培养条件下细菌代谢产生抗菌物质及色素的情况
• 2.3 不同培养条件下细菌NJ6-3-1 的抗菌活性与细胞密度的关系
• 2.4 不同培养条件下细菌抗菌活性物质的代谢情况
• 2.5 加入不同外源诱导物质后细菌NJ6-3-1 抗菌活性产物的代谢情况
• 3 讨论
• 第四章 受群体感应调控抗菌物质的分离纯化及结构鉴定
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验菌株、试剂及仪器
• 1.1.1 实验菌株
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 菌株培养和发酵
• 1.3 细菌代谢产物的提取
• 1.4 细菌抗菌代谢产物的分离纯化
• 1.4.1 硅胶柱层析
• 1.4.2 TLC 薄板层析
• 1.4.3 TLC 制备薄板层析
• 1.4.4 高效液相色谱（HPLC）
• 1.5 化合物结构的表征与解析
• 1.5.1 HPLC/ESI TOF-MS 对化合物分子量的测定
• 1.5.2 NMR 测定
• 2 结果
• 2.1 细菌NJ6-3-1 代谢产物中抗菌化合物的分离纯化
• 2.2 细菌NJ6-3-1 代谢产物中抗菌化合物的结构解析
• 3 讨论
• 第五章 DKPs 化合物对NJ6-3-1 抗菌活性的调控作用
• 1 前言
• 2 实验材料
• 2.1 实验菌株
• 2.2 实验试剂和仪器
• 3 方法
• 3.1 自诱导实验
• 3.1.1 培养基的配制
• 3.1.2 接种和培养
• 3.1.3 DKPs 的配制
• 3.1.4 诱导物的添加
• 3.2 海洋细菌代谢产物的提取
• 3.3 代谢产物抗菌活性检测
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 第六章 种间群体感应物质的初步探索
• 1 实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 实验试剂和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 菌株培养
• 2.2 不同外源诱导物的获得
• 2.3 外源诱导物质的添加
• 2.4 海洋细菌代谢产物的提取
• 2.5 代谢产物抗菌活性检测
• 3 结果与讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录