以壳聚糖为载体新城疫DNA疫苗纳米粒的制备及其免疫效果

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种高度接触性、致死性的禽类传染病,对养禽业造成严重的危害。对于ND的预防免疫接种,常用的是弱毒苗和灭活苗,但它们在实际应用中具有一定的局限性,弱毒苗易变异,易产生返祖现象;灭活苗起效慢。应用DNA疫苗防治ND的研究是当今研究的热点,虽然DNA疫苗在某些方面优于传统疫苗,但是其在胃肠道内易降解,而运用可生物降解材料构建纳米粒黏膜免疫递送系统可避免DNA疫苗易降解、靶向性差、免疫次数多的弊端。本试验选用可生物降解材料壳聚糖为载体,以新城疫DNA疫苗pVAXl-optiF为模型,采用复凝法和包衣法分别制备pDNA-CS-NPs和pDNA-CS-PLGA-NPs,并对纳米粒的制备工艺及其影响因素、理化特性、药物稳定性、细胞毒性和免疫效果等进行了较为详细的研究。试验结果表明:1)采用复凝法制备出了大小均一、形态规则、分散性好的pDNA-CS-NPs,平均粒径为199.5nm,分散系数为0.336,Zeta电位为+ 11.2mV,包封率为（98.59±0.03）%（n=5）,载药量为（36.12±0.19）%（n=5）;2)采用包衣法制备出了大小均一、形态规则、表面光滑、圆球形的pDNA-CS-PLGA-NPs,平均粒径为699.1nm,分散系数为0.005,Zeta电位为+6.35mV,包封率为（98.12土0.35）%（n=5）;3)体外抗DNase Ⅰ降解试验结果表明,制备的pDNA-CS-NPs可以避免核酸酶的降解,质粒DNA被壳聚糖包裹后,结构没有受到破坏,保持了其生物活性;4)体外释放试验结果表明,pDNA-CS-NPs具有缓释质粒DNA的作用,而pDNA-CS-PLGA-NPs达到了更好的缓释效果,避免了突释现象;5)间接免疫荧光试验和Western blotting试验结果表明,本研究确定的pDNA-CS-NPs和pDNA-CS-PLGA-NPs制备方法没有破坏质粒DNA的生物活性;6)细胞毒性试验结果表明,pDNA-CS-NPs和pDNA-CS-PLGA-NPs的毒性较小,具有较高的安全性;7)SPF鸡体内免疫试验结果表明,通过滴鼻免疫pDNA-CS-NPs和pDNA-CS-PLGA-NPs产生的黏膜免疫比肌肉注射更能活跃的激活黏膜免疫应答部位,产生高水平的IgG和IgA水平,并能达到高的保护率,说明以壳聚糖为载体的新城疫DNA疫苗纳米粒不仅能在黏膜局部产生免疫应答,还可以引起机体的体液免疫应答和细胞免疫应答。本试验成功构建了以壳聚糖为载体的新城疫DNA疫苗纳米粒黏膜免疫递送系统,此纳米粒黏膜免疫递送系统可实现疫苗在体内的长效作用机制,从而达到降低用药成本、减少免疫次数、增加免疫途径的目的;同时,也为纳米黏膜疫苗在临床的广泛应用提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 新城疫
• 1.1.1 新城疫病毒概述
• 1.1.2 新城疫病毒的致病机理
• 1.1.3 新城疫的诊断与控制
• 1.1.4 新城疫疫苗类型
• 1.2 黏膜免疫
• 1.2.1 黏膜免疫系统
• 1.2.2 黏膜免疫的疫苗
• 1.2.3 免疫佐剂
• 1.3 纳米疫苗黏膜免疫递送系统
• 1.3.1 纳米疫苗黏膜免疫递送系统常用的材料
• 1.3.2 壳聚糖作为黏膜疫苗基因载体和免疫佐剂的优越性
• 1.3.3 壳聚糖作为黏膜疫苗基因载体和免疫佐剂的作用机制
• 1.3.4 壳聚糖纳米粒的制备
• 1.3.5 纳米黏膜疫苗的免疫途径
• 1.3.6 纳米疫苗黏膜免疫递送系统的应用
• 1.4 本试验研究的目的意义及主要内容
• 1.4.1 本试验研究的目的和意义
• 1.4.2 本试验研究的主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 质粒、细菌、细胞、阳性血清和毒株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要生化与分子生物学试剂
• 2.1.4 常用溶液的配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 新城疫DNA疫苗的大量制备和纯化
• 2.2.2 pDNA-CS-NPs的制备
• 2.2.3 pDNA-CS-PLGA-NPs制备
• 2.2.4 统计分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 质粒pVAX1-optiF的鉴定
• 3.2 pDNA-CS-NPs的制备
• 3.2.1 pDNA-CS-NPs制备条件的优化
• 3.2.2 pDNA-CS-NPs制备的最佳工艺
• 3.2.3 pDNA-CS-NPs形态、粒径分布和Zeta电位检测
• 3.2.4 pDNA-CS-NPs包封率和载药量的测定
• 3.2.5 pDNA-CS-NPs抗DNaseI降解
• 3.2.6 pDNA-CS-NPs体外释放
• 3.2.7 pDNA-CS-NPs体外表达
• 3.2.8 pDNA-CS-NPs安全性检测
• 3.2.9 pDNA-CS-NPs免疫效果的评价
• 3.3 pDNA-CS-PLGA-NPs的制备
• 3.3.1 pDNA-CS-PLGA-NPs的制备条件的优化
• 3.3.2 优化的pDNA-CS-PLGA-NPs的制备工艺
• 3.3.3 pDNA-CS-PLGA-NPs形态、粒径分布和Zeta电位检测
• 3.3.4 pDNA-CS-PLGA-NPs包封率的测定
• 3.3.5 pDNA-CS-PLGA-NPs体外释放
• 3.3.6 pDNA-CS-PLGA-NPs体外表达
• 3.3.7 pDNA-CS-PLGA-NPs安全性评价
• 3.3.8 pDNA-CS-PLGA-NPs免疫效果评价
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 第6章 本论文的主要创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文情况
• 攻读硕士学位期间参与研究课题情况