论文摘要
研究发现氨基肽酶（aminopeptidase, APN）是冠状病毒的细胞感染受体,同属于I群冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、人冠状病毒229E、猫冠状病毒等都以相应的氨基肽酶作为其细胞感染的受体。本研究以pMD18-T-pAPN为模版,设计了一对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,将pAPN基因克隆出来并插入到真核表达载体pEFP-C1的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建了重组质粒pEGFP-C1-pAPN。经公司测序,所插入的pAPN基因连接位点正确,并利用三维蛋白空间结构预测软件预测分析,pAPN基因可以和GFP基因融合表达,所表达出的蛋白的空间结构相互没有影响,与自然存在的蛋白结构相符。选用PEDV非许可性细胞犬肾细胞（Madin-Darby canine kidney, MDCK）,通过脂质体介导的方法将重组质粒转染至MDCK细胞中,利用载体pEFP-C1含有中新霉素磷酸转移酶抗性基因的特性,向细胞培养液中添加新霉素抗性药物G418筛选,同时运用荧光检测手段,实时检测GFP蛋白的表达情况。经过筛选,筛选出了几株有G418抗性MDCK细胞系,此时,提取该MDCK细胞的总RNA,用OligdT将mRNA进行反转录,针对pAPN基因设计一对检测引物进行RT-PCR反应,检测出了3株转染MDCK细胞有pAPN基因mRNA转录。用PEDV对该3株MDCK细胞系进行感染,有2株产生细胞病变,证明了pAPN在MDCK细胞中表达;同时将该MDCK细胞传10代后,去除选择压力G418药物,并续传至20代后,PEDV感染实验结果还可以产生病变,证明了pAPN在该MDCK细胞中表达稳定。经抗pAPN血清及抗PEDV S蛋白血清中和实验的验证,进一步表明pAPN在PEDV细胞感染过程中起关键作用,推测PEDV S蛋白也参与此过程中,很可能是受体是pAPN,配体是PEDV S蛋白。本实验结果在MDCK细胞上表达了pAPN,经证明PEDV可以在该细胞系上繁殖,从理论上阐明了pAPN最为冠状病毒受体在PEDV感染中的作用,为冠状病毒受体的研究提供了良好的技术平台。