麝香百合T-DNA插入突变群体的构建与分析

论文摘要

百合是世界三大鳞茎类花卉之一,具有重要的商品价值。年产18亿个种球,创汇约12亿美元（荷兰）。虽然传统育种在百合的遗传育种中具有重要作用,但由于远缘杂交的不亲和性以及育种年限过长等缺点,远不能满足生产需要。我国百合生产严重缺乏具有自主知识产权的新品种,用于百合生产的种球几乎完全依赖进口。进口种球存在成本高、品种杂乱、品质下降等严重问题。虽然目前可以采用鳞茎等组织培养技术进行百合脱毒和扩繁,但组织培养过程中存在污染严重、繁殖系数低、繁殖速度慢、组培苗移栽成活率低等问题,极大地限制了百合商品种球的生产。为此,本研究从解决百合离体快繁中的关键技术问题入手,采用农杆菌介导的T-DNA插入技术,构建百合T-DNA插入突变群体,通过对突变群体的筛选,获得了一些具用异常表型的突变体,并克隆了一些与突变性状有关的基因,具有重要的理论和实际意义。采用两步外植体法即以低温预处理过的百合鳞片切块为初始外植体,以从初始外植体上分化的丛生芽切段为次级外植体,结合直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统,成功地实现了麝香百合的高频离体再生。我们的结果是:一个中等大小的百合鳞茎,经过低温预处理后,通过直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统1代就可以分别扩繁出54,000和67,500个独立完整的带小鳞茎的新植株,且从鳞茎到新植株的开花仅需8-9个月左右,它不仅解决了百合离体快繁中的污染严重问题、还大大提高了繁殖系数和繁殖速度。这一结果是国内外已见报导的技术方法所不能达到的。与此同时我们还研究了不同激素配比的培养基以及次级外植体的不同部位对芽和愈伤组织分化的影响效果,研究了不同培养基质对组培苗移栽成活的影响,研究了不同的低温处理时间对组培苗开花的影响,发现MS+1.0mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是芽的诱导及伸长的最佳培养基;MS+2.0 mg/L 2,4-D+ 0.1mg/L 6-BA是诱导愈伤组织的最适宜培养基;无论是诱导芽还是诱导愈伤组织,以短缩茎为次级外植体效果最好;沙:园土:椰糠=1:1:1的培养基质是最好最经济的组培苗驯化移栽培养基质,这大大提高了组培苗的移栽成活率;不同的低温处理时间对组培苗开花期的影响不大。在此高频离体再生系统的基础上,采用农杆菌介导的T-DNA插入突变技术,从2400块左右的次级外植体中,通过直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统分别得到了4500和500株左右的NPTII抗性植株,抗性植株比率分别为187%和21%,

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 百合产业在经济发展中的作用
• 1.2 百合的遗传育种研究进展
• 1.3 T-DNA 在植物功能基因组学上的应用
• 1.4 本研究目的、意义
• 1.5 本研究的技术路线
• 2 百合高频离体再生体系的建立
• 2.1 植物材料与处理
• 2.2 培养方法及培养条件
• 2.3 结果与分析
• 2.4 结论与讨论
• 3 百合T-DNA 插入突变群体的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 结论与讨论
• 4 百合T-DNA 插入突变群体的筛选
• 4.1 基因捕捉系统检测
• 4.2 T0 代转基因植株的分子检测
• 4.3 T0 突变植株的插入拷贝数分析及其侧翼序列的扩增
• 4.4 T1 代转基因植株的分子生物学检测
• 4.5 结论与讨论
• 5 本研究的特色与创新之处
• 5.1 本研究特色
• 5.2 本研究创新之处
• 参考文献
• 缩写词表（ABBREVIATION）
• 致谢
• 摘要
• Abstract