白藜芦醇（Resveratrol）诱导肺腺癌A549细胞凋亡的实验研究

论文摘要

【背景及目的】在许多植物中都发现有白藜芦醇，比如虎杖，葡萄等，它的作用也得到越来越多人的关注，最近对于它的抗癌作用研究的比较多。白藜芦醇可以抑制癌细胞生长，这在体外培养细胞实验已经得到证实。本文目的就是验证白藜芦醇具有抑制肺腺癌A549细胞生长并促进其凋亡的作用。位于15号染色体上的pml基因所编码的PML蛋白质是一种细胞生长因子和促凋亡因子，PML蛋白对癌细胞有抑制生长和诱导凋亡的作用。前期研究已经成功构建了敲除了pml基因的A549细胞与对照组A549细胞，用MTT法研究白藜芦醇对于两种细胞的生长抑制作用，结果发现白藜芦醇对于这两种细胞都有生长抑制作用，且发现白藜芦醇对于这两种细胞的抑制作用有差别。在白藜芦醇诱导下，就可以将野生型A549细胞周期阻滞在G1期，且呈剂量依赖性的抑制细胞生长并促进凋亡。在此基础上，本文对白藜芦醇抑制体外培养的人肺腺癌A549细胞生长、诱导凋亡及其机制进行了研究。【材料和方法】体外培养的人肺腺癌A549细胞，用含不同浓度白藜芦醇的培养基处理，倒置相差显微镜观察A549细胞的形态学变化；MTT法检测细胞存活率；DAPI染色观察细胞凋亡；流式细胞术检测细胞周期阻滞情况；通过双向电泳分析白藜芦醇处理后细胞全蛋白的表达差异，软件分析蛋白，质谱分析鉴定差异蛋白，对Res诱导细胞凋亡的通路进行初步判断；通过Western Blotting分别对细胞周期和凋亡相关蛋白（P53,PML, Bcl-2,Wrap53）等进行检测；通过PCR检测相关基因（p53,pml,wrap53）的表达；免疫荧光检测相关蛋白（P53,PML,Wrap53）的表达和结合情况；通过siRNA干扰pml基因表达后检测P53和Wrap53蛋白与基因水平。【结果】1. MTT法检测，不同浓度Res对野生型肺腺癌A549细胞均有不同程度的杀伤作用，经过计算IC50为100μM。2. DAPI染色实验显示当Res浓度达到100μM，作用时间达到24h时，有明显的特征性凋亡小体的出现。3.流式细胞术检测结果显示25μM, 50μM，100μM和200μM Res处理组细胞周期G1期细胞比例分别为69.38%, 73.82%, 80.33%，73.28%，而未加Res的对照组细胞G1期细胞比例为54.53%。表明当Res作用浓度为25μM时，就可以诱导肺腺癌A549细胞细胞周期阻滞在G1期，达到50μM和100μM时则使阻滞在G1期的A549细胞数量明显增多。4. Western Blotting检测细胞周期和凋亡相关蛋白，随着白藜芦醇作用浓度增加和作用时间增长，结果P53蛋白逐渐被激活；而PML蛋白逐渐减弱；Bcl-2/Bax的变化不明显；5. PCR检测pml基因在25，50，100μM作用24h时呈现激活状态,200μM时pml基因表达水平比较低；p53基因随着加药浓度增加先激活后抑制，而wrap53基因持续激活。6.免疫荧光实验检测PML，P53,Wrap53原位蛋白表达情况，发现PML蛋白随着白藜芦醇加药浓度增加表达逐渐降低。【结论】1．白藜芦醇能在一定浓度范围内在体外抑制人肺腺癌A549细胞的生长和增殖，并且这种作用呈时间和剂量依赖关系。2．白藜芦醇在一定浓度范围内能有效的诱导A549细胞凋亡，并改变其细胞周期的分布，有明显的G1/S期阻滞作用。3．白藜芦醇能够上调P53的表达，抑制PML的表达，且Bcl-2/Bax的比值基本不变，可能在A549细胞中不是通过抑制Bcl-2激活Bax诱导细胞凋亡。4．PML在蛋白水平被抑制，但在RNA水平先激活后抑制，推测蛋白水平的抑制可能不是通过基因水平，可能是在转录后，或在翻译水平。5．低浓度的白藜芦醇都可以在RNA水平激活wrap53和p53，推测可能在低浓度时通过先激活wrap53来激活p53，且沉默wrap53基因后，p53也随之下调也从侧面证明之。6．免疫荧光观察到PML蛋白原位定位在核内，而且随着白藜芦醇浓度的提高，表达逐渐被抑制。同时在核内观察到PML蛋白和P53蛋白大部分共定位，PML蛋白和Wrap53蛋白、P53蛋白和PML蛋白分别部分共定位。

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摘要

Abstract

英文缩略词

第一章前言

第二章实验材料

2.1 细胞株

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器与设备

第三章实验方法

3.1 细胞培养

3.1.1 细胞复苏

3.1.2 细胞传代

3.1.3 细胞冻存

3.2 细胞形态观察

3.3 DAPI 细胞核荧光染色

3.4 MTT 法检测细胞增殖活性

3.5 流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡

3.6 Western Blotting 检测蛋白变化情况

3.6.1 A549 细胞全蛋白的提取

3.6.2 BCA 法测定蛋白浓度

3.6.3 SDS-PAGE 分离蛋白

3.6.4 免疫印迹（Western Blotting）分析

3.6.5 图像分析

3.7 免疫荧光染色

3.7.1 样品制备

3.7.2 固定

3.7.3 孵育一抗

3.7.4 孵育二抗

3.7.5 荧光显微镜上观察

3.7.6 注意事项

3.8 双向电泳

3.8.1 细胞样品的制备

3.8.2 细胞全蛋白除盐

3.8.3 Bradford 法测定蛋白浓度

3.8.4 第一向等电聚焦（IEF）

3.8.5 第二向SDS 电泳

3.9 PCR 检测基因水平

3.9.1 荧光定量PCR 引物的设计合成

3.9.2 提取细胞总RNA

3.9.3 RNA 的电泳鉴定

3.9.4 逆转录

3.9.5 PCR 扩增

3.10 用siRNA 技术沉默pml 和wrap53 后检测p53 基因和蛋白水平

3.10.1 永久转染实验步骤

3.10.2 瞬时转染实验步骤

第四章实验结果

4.1 白藜芦醇对野生型A549 细胞作用的形态学观察

4.2 白藜芦醇对野生型A549 细胞生长的影响

4.3 细胞凋亡的DAPI 检测

4.4 流式细胞技术分析细胞周期

4.5 Western Blotting 检测不同浓度白藜芦醇作用野生型A549 细胞后，对P53，PML，Bcl-2，Bax 蛋白的变化

4.6 Western Blotting 检测100μM 白藜芦醇作用野生型A549 细胞后，不同时间段对P53，PML，Bcl-2，Bax 蛋白的变化

4.7 Western Blotting 检测200μM 白藜芦醇作用野生型A549 细胞后，不同时间段对P53，PML，Bcl-2，Bax 蛋白的变化

4.8 免疫荧光检测原位PML 表达

4.9 免疫荧光检测原位野生型A549 细胞PML 和P53，PML 和Wrap53，P53 和Wrap53 的结合

4.10 双向电泳分析白藜芦醇诱导A549 细胞凋亡过程中蛋白变化

4.11 实时定量PCR 检测基因野生型A549 细胞pml mRNA

4.12 稳定干涉PML 表达的A549 细胞后，检测PML 和P53 蛋白

4.13 稳定干涉PML 基因表达的A549 细胞后，实时定量PCR 检测p53 和wrap53 mRNA

4.14 实时定量PCR 检测野生型A549 细胞p53 和wrap53 mRNA

4.15 瞬时沉默野生型A549 细胞wrap53 基因后，实时定量PCR 检测p53 基因水平

第五章讨论

第六章结论

参考文献

附录

综述

参考文献

个人简历

研究生期间论文发表情况

致谢

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