大肠杆菌O157：H7酶免疫传感器的研究

论文摘要

肠出血性大肠埃希菌（enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）是近年来危害最严重的致病肠道菌之一,0157:H7是EHEC最主要的血清型,可引起出血性结肠炎（Hemorrhagic colonitis HC）、溶血性尿毒综合征（uremic syndrome hemolytic HUS）和血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura TTP）。HC是最常见的临床症状,HUS和TTP的病死率比较高,有时可高达30%以上。由于E.coli O157:H7感染剂量极低,且病情发展快,死亡率高,近年来欧美、日本等国都有多次爆发流行及散发病例报道,对人类健康构成严重威胁,因此建立特异、灵敏及快速的E.coli O157:H7检测方法显得尤为重要。目前E.coli O157:H7的主要检测方法有:生化法、免疫法、分子生物法三大类。我国目前对E.coli O157:H7检测大多数是采用生化法,从细菌分离、培养、鉴定需要l周左右的时间,耗时耗材,而且检出率较很低,显然对E.coli O157:H7等病原体的暴发诊断不适宜。其它方法如:胶体金试纸法灵敏度低且不能定量,而DNA探针技术、PCR技术等方法存在操作复杂、仪器设备及人员要求高的不足。酶免疫传感器是近年发展起来快速检测致病微生物的一项新技术,它将酶电极的电化学放大作用与免疫电极的特异性相结合,不但具有免疫反应的特异性和电化学分析的灵敏性,而且具有检测设备相对简单,使用方便,构建酶免疫电极方法灵活,体系容易集成化,微型化等优点。它在食品致病菌分析方面已取得良好效果。在酶免疫传感器的构建中,其关键技术是酶的固定,使固定化状态的酶呈现最大的生物活性,具有较高的稳定性可在较宽的pH范围或不同pH的下操作,并且尽量避免或减少酶的泄漏。本研究采用了三种不同的酶固定方法:吸附法、分子自组装膜技术、电沉积法建立快速检测E.coli O157:H7的新型酶免疫传感器,并对其性能特点分别进行研究探讨。第一部分吸附固定的E.coli O157:H7酶免疫传感器的研究目的:将免疫法特异性和电化学法灵敏性相结合,建立一种快速检测E.coli O157:H7的新型酶免疫传感器。方法:采用吸附法及抗原抗体特异性反应将E.coli O157:H7单克隆鼠抗固定在辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG修饰的玻碳电极表面,制备用于检测E.coli O157:H7的酶免疫传感器。通过循环伏安法和恒电位法测定E.coli O157:H7被固定在电极表面引起的电信号改变进行定量分析。结果:该酶免疫传感器的检出限为5×102cfu/mL,检测线性范围为103～105cfu/mL,相关系数为R=0.970,表观米氏常数Kamp p值为12.08mmol/L,传感器响应电信号2周后为初值的80%。结论:该传感器制备方法简单,检测时间短,操作简单,可进一步进行深入研究。第二部分纳米金/L-半胱胺酸修饰的E.coli O157:H7酶免疫传感器的研究目的:建立基于纳米金/L-半胱胺酸修饰的E.coli O157:H7酶免疫传感器。方法:采用分子自组装膜技术和抗原抗体特异性反应将E.coli O157:H7单克隆鼠抗固定在辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG/纳米金/L-半胱胺酸修饰的金电极表面,制备用于检测E.coli O157:H7的酶免疫传感器。通过循环伏安法和恒电位法测定E.coli O157:H7被固定在电极表面引起的电信号改变进行定量分析。结果:该酶免疫传感器的检出限为2×102cfu/mL,检测线性范围为103～105cfu/mL,相关系数为R=0.990,表观米氏常数Kamp p值为9.69mmol/L,传感器响应电信号2周后保持不变。结论:与前面的吸附法相比较L-半胱胺酸和纳米金的引入增强了电子在酶和电极之间的传导能力,提高了酶和抗体的固定量及生物活性,使酶免疫电极的灵敏度和稳定性增大。第三部分基于纳米金修饰的E.coli O157:H7酶免疫传感器的研究目的:建立基于纳米金修饰的E.coli O157:H7酶免疫传感器。方法:通过电沉积法及静电吸附作用和抗原抗体特异性反应将E.coli O157:H7单克隆鼠抗固定在辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG/纳米金修饰的玻碳电极表面,制备用于检测E.coli O157:H7的酶免疫传感器。通过循环伏安法和恒电位法测定E.coli O157:H7被固定在电极表面引起的电信号改变进行定量分析。结果:在含0.1mol/LPBS（pH7.4）,1mmol/L二甲氨基甲基二茂铁,0.2mmol/L H2O2,30℃的底液中该酶免疫传感器的检出限为102cfu/mL,检测线性范围为103～105cfu/mL,相关系数为R=0.996,表观米氏常数Kampp值为9.02mmol/L,传感器响应电信号2周后为初值的85%。结论:该传感器制备方法与前两种相比更简单,酶的固定量更多,灵敏度更高。综上所述,酶的固定方法对制备E.Coli O157:H7酶免疫生物传感器非常重要,在吸附法中未修饰金纳米的酶免疫传感器检测的电信号较弱、稳定性与灵敏度较低,而在分子自组装方法和电沉积方法中,纳米金颗粒的表面效应使羊抗鼠IgG-HRP被大量吸附并保持其生物活性,且纳米金良好的导电性也提高了酶免疫生物传感器的电流响应性能。在三种方法中电沉积法由于电极表面沉积纳米金颗粒数量多,在固定酶和抗体同时保持其生物活性和稳定性,增强电子传导信号优于前两种方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 吸附固定的E.COLI 0157:H7 酶免疫传感器的研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第二部分 纳米金/L-半胱胺酸修饰的 E.COL I O157:H7 酶免疫传感器的研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第三部分 纳米金修饰的E.COLI 0157:H7 酶免疫传感器的研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述 酶免疫生物传感器
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢