论文题目: 转核酶基因、反义和正义CMV-CP基因番茄的抗黄瓜花叶病毒（CMV）研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物学
作者: 朱秋菊
导师: 匡廷云,李良璧
关键词: 黄瓜花叶病毒,外壳蛋白基因,基因克隆,核酶基因,反义基因片段,正义基因片段,番茄,基因转化,抗测定
文献来源: 中国科学院研究生院（植物研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)引起的番茄病毒病十分普遍和严重,已经成为影响番茄产量和品质的最主要病害之一。在我国,每年CMV造成的番茄产量损失占总产量的15%以上,经济损失可达数十亿元人民币。到现在为止,还没有出现防御CMV侵染,减少产量损失的有效策略。由于缺乏天然的植物抗CMV基因,常规育种方法不能满足生产上的需要。近几年植物基因工程和分子生物学的快速发展,为植物抗病育种开辟了新途径。核酶技术是近年来发展的高新生物技术之一。核酶(ribozyme)是一类具有类似于蛋白质酶催化功能的RNA分子,能够在分子内切割RNA特定序列的磷酸二脂键。核酶可以切割RNA病毒的核酸,达到抗病毒目的,被用于植物抗病毒研究中; 基因沉默(gene silencing)机制是近几年来分子生物学中的研究热点。基因沉默是原始真核生物就具有的一种古老的病毒防御体系。除了可以防御病毒,还可以保护植物基因组免受转座子和转基因等外源基因的入侵; 反义RNA技术用在转基因植物中,能抑制植物基因的表达和病毒的复制。我们利用基因转化方法,对核酶、基因沉默和反义RNA技术在抗病中的应用进行探讨。本研究的主要结果有如下几点: CMV华北地区流行株系外壳蛋白(coat protein,CP)基因的克隆:从河北番茄生产地块采集有典型症状的发病叶片,经酶联免疫法(DAS-ELISA)测定,证实有CMV的存在,将此株系编号为988LJ。用RT-PCR法克隆了1049bp长的CMV-CP基因的cDNA序列,包括657bp的编码区,所编码蛋白的氨基酸残基数为218。经序列分析比较,与已报道的其他CMV株系有很高的同源性。核酶基因、反义及正义CP基因三个植物表达载体的构建:选择988LJ株系CP基因序列上的四个位点,设计合成了有四个催化区域,抗CMV的锤头型核酶基因(4rz)构件,并转化到载体中,得到了核酶基因表达载体。同时将CP基因中与核酶区域相同,但不包括催化区的部分序列反向和正向插入到载体中,得到反义(as)和正义(se)基因表达载体。转化三种植物表达载体的番茄再生植株的获得:通过农杆菌转化法对三个番茄栽培品种进行转化,各个载体和品种都获得了大量的转基因植株。对导入的核酶基因及反义、正义CP基因片段,标记基因新霉素磷酸转移酶基因nptII进行
论文目录:
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缩写词
第一章 黄瓜花叶病毒及抗病毒基因工程研究进展
一、植物病毒及其分类
1. 病毒的主要特征
2. 植物病毒的分类及在生物研究中的作用
二、黄瓜花叶病毒(CMV)
1. CMV 的基本特征
2. CMV 的核酸组成
3. CMV 株系鉴定
4. CMV 对作物的为害
三、病毒病对植物光合作用的影响
四、抗病毒基因工程研究进展
1. 传统防治方法的局限性
2. 植物对病毒的天然抗病性
3. 病原物来源的抗病性(PDR)
4. 转录后基因沉默(PTGS)
4.1 基因沉默
4.2 PTGS 的分子机制
4.3 病毒对PTGS 的反抑制
5. 病毒诱导的基因沉默(VIGS)
6. 病毒基因来源的抗性策略实例
6.1 外壳蛋白基因策略
6.2 病毒非结构蛋白基因策略
6.3 反义 RNA 策略
6.4 双链RNA 策略
6.5 病毒卫星RNA 基因策略
7. 其他来源的抗病策略
7.1 抗体基因策略
7.2 与干扰素有关的基因策略
五、核酶技术及应用
1. 核酶的作用机理和结构特点
2. 人工构建核酶基因的方法
3. 核酶在生物学中的应用
六、本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
第一节 实验材料
第二节 实验方法
第三章 结果与分析
一、CMV 株系988LJ 外壳蛋白基因的克隆
二、抗CMV-CP 基因锤头型核酶的构建
三、核酶活性的体外检测
四、植物表达载体的构建
1. 质粒构建过程
2. 植物表达载体的酶切鉴定
3. 根癌农杆菌的转化
五、番茄的遗传转化
1. 植株再生及特异性分化
2. Km 浓度使用量的确定
六、转基因番茄的生长
七、T_0代番茄种子的发芽试验
八、PCR 鉴定番茄和烟草转化体的基因
九、转基因番茄的 Southern 检测
十、转基因番茄植株抗 CMV 鉴定
1. 转基因番茄T_1 代抗CMV 检测
2. 转基因番茄T_2代抗CMV 检测
十一、CMV 侵染对番茄叶绿素含量的影响
十二、CMV 侵染对叶片荧光动力学参数的影响
十三、讨论
1. CMV 株系的鉴定和序列分析比较
2. 核酶基因载体的构建
3. 反义和正义CP 基因载体的构建
4. 番茄栽培品种的再生及转化系统的建立
5. 转基因番茄的分子鉴定
6. 转基因番茄后代抗CMV 鉴定
7. 转基因番茄受病毒侵染后的光合指标变化
第四章 结论
参考文献
在读期间已发表和待发表的文章
致谢
发布时间: 2006-04-30
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