Notch 1在人脑胶质细胞瘤中的表达及其胞内段真核表达载体的构建

论文摘要

Notch信号是一个在进化上高度保守的信号途径,在脊椎动物和无脊椎动物胚胎发育过程中发挥重要作用。相邻细胞通过Notch受体进行的信号交换能够放大和巩固分子差异,最终决定细胞命运。Notch受体和配体均属于I型膜蛋白,目前为止在人类发现了四种Notch受体（Notch 1～4）以及五种相应的配体,包括Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4、Jagged-1和Jagged-2。Notch信号的激活需要结合邻近细胞的配体。当受体与配体结合后,受体的胞内部分被酶切下来进入细胞核,在细胞核内影响大量转录因子的表达。因此,Notch信号能够正向或负向影响细胞的增殖、分化和凋亡。长期以来,Notch信号被认为对神经系统发育的许多方面具有重要的影响,包括神经元的分化和胶质细胞命运决定。Notch信号能够抑制神经元的分化,同时直接促进星形胶质细胞的分化。然而,在Notch信号激活的情况下,起源于胶质母细胞的少突胶质母细胞不能分化为成熟的少突胶质细胞。Notch信号能够在神经系统发育过程中调控细胞命运决定的重要性表明,在胶质瘤细胞中可能存在Notch信号的调控异常。Purow等研究表明,Notch 1及其配体Delta-like-1、Jagged-1在多个胶质瘤细胞系及人原发性胶质瘤中呈过表达;通过RNA干扰分别下调Notch 1、Delta-like-1及Jagged-1的表达,均能够在多个胶质瘤细胞系中诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。与之矛盾的是,Somasundaram等研究认为,Notch信号的抑制可能是胶质瘤进展的重要早期事件。难道Notch信号的激活实际上不利于胶质瘤细胞的生长吗?要解决Notch信号的矛盾,可能有赖于对Notch信号在胶质瘤发生和进展过程中作用机制的进一步理解。基于此,本课题从以下两方面进行了研究。一、Notch 1在人脑胶质细胞瘤中的表达及意义:采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测4株人脑胶质瘤细胞系（U251、U87、BT325、SHG-44）中Notch 1 mRNA的表达水平;采用免疫组化检测15例人正常脑组织和159例人脑胶质瘤组织中Notch 1蛋白的表达水平。结果显示,Notch 1 mRNA在4株人脑胶质瘤细胞系均有表达;Notch 1蛋白在星形细胞瘤及少突胶质细胞瘤中的表达阳性率和免疫反应评分分别高于正常脑组织中的表达阳性率和免疫反应评分（P<0.05）,而Notch 1蛋白在髓母细胞瘤的表达阳性率和免疫反应评分与正常脑组织相比无统计学差异（P>0.05）。星形细胞瘤各病理级别之间,Notch 1蛋白的表达阳性率无统计学差异（P>0.05）,毛细胞型星形细胞瘤（WHO I级）和间变型星形细胞瘤（WHO III级）Notch 1蛋白的免疫反应评分明显高于弥漫型星形细胞瘤（WHO II级）和胶质母细胞瘤（WHO IV级）（P<0.05）。少突胶质细胞瘤各病理级别之间,Notch 1蛋白的表达阳性率无统计学差异（P>0.05）,少突胶质细胞瘤（WHO II级）Notch 1蛋白的免疫反应评分明显高于间变型少突胶质细胞瘤（WHO III级）（P<0.05）。结果提示,与正常脑组织相比,Notch 1蛋白在星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤中呈高表达;Notch信号可能与胶质瘤的发生和发展密切相关。二、人源性Notch 1胞内段真核表达载体的构建及鉴定:通过逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）从人脑胶质母细胞瘤细胞系U251细胞中获得编码NICD的cDNA,定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP;经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内NICD的表达。结果显示,编码NICD的cDNA已定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,将真核表达载体pIRES2-EGFP-NICD转染HeLa细胞72 h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内NICD的表达显著增高。结果提示,已成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-NICD,为研究Notch信号通路在人脑胶质细胞瘤发生发展中的作用机制奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一、Notch 信号在中枢神经系统肿瘤的研究概况
• 二、免疫组织化学染色与抗原热修复
• 正文
• 实验一 Notch 1 在人脑胶质瘤中的表达及意义
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 组织标本
• 1.3 主要工作液
• 1.4 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 引物设计及合成
• 2.3 细胞总RNA 提取
• 2.4 反转录合成cDNA 第一链
• 2.5 PCR 检测Notch 1 mRNA 在人脑胶质瘤细胞系的表达
• 2.6 免疫组化染色方法
• 2.7 免疫组化结果判读
• 2.8 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 Notch 1 mRNA 在人脑胶质瘤细胞系中的表达
• 3.2 Notch 1 蛋白在人正常脑组织和人脑胶质瘤组织中的表达与定位
• 3.3 Notch 1 蛋白表达与临床病理学分级的关系
• 4 讨论
• 实验二 人源性Notch 1 胞内段真核表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 细胞株和菌种
• 1.2 质粒
• 1.3 主要工作液
• 1.4 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计及合成
• 2.2 细胞培养
• 2.3 细胞总RNA 提取
• 2.4 反转录合成cDNA 第一链
• 2.5 PCR 扩增Notch 1 胞内段cDNA
• 2.6 DNA 凝胶回收
• 2.7 目的DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.9 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.10 阳性克隆的筛选
• 2.11 质粒提取
• 2.12 目的基因与真核表达载体的连接
• 2.13 细胞转染
• 2.14 蛋白样品制备
• 2.15 蛋白免疫印迹
• 3 结果
• 3.1 细胞总RNA 质量的鉴定
• 3.2 人源性Notch 1 胞内段cDNA 的克隆及鉴定
• 3.3 真核表达载体pIRE52-EGFP-NICD 的构建及鉴定
• 3.4 真核表达载体pIRE52-EGFP-NICD 在细胞中的表达
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 个人简历
• 发表论文
• 致谢