硫化叶菌阿拉伯糖启动子转录调控及其应用

论文摘要

微生物可以利用不同的糖作为碳源和能源,如大肠杆菌可以利用乳糖和L-阿拉伯糖,单细胞真核生物酵母可以利用半乳糖；而这些糖代谢相关基因的表达都受底物诱导并被精细地调控。在生命第三域中,极端嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus P2）可以利用多种糖作为碳源,其中D-阿拉伯糖是一种速效碳源并能够诱导多个基因包括阿拉伯糖操纵子（ara operon）的表达。并且阿拉伯糖操纵子的转录受第一个基因启动子即araS启动子的控制。因此研究araS启动子中的顺式元件及其作用方式对于揭示古菌糖代谢转录调控机理及古菌转录调控基本模式具有重要意义。因此,我们建立了一个硫化叶菌报告基因体系来分析古菌启动子的DNA顺式元件。该体系以lacS基因作为报告基因,将古菌启动子如araS启动子与lacS基因融合,使lacS受该启动子控制,然后将启动子-lacS基因融合序列插入E.coli-Sulfolobus穿梭质粒,构建成硫化叶菌报告质粒。其中插入的启动子序列可以通过PCR的方法进行缺失突变和颠换突变。该体系的宿主菌是S. islandicus E233S pyrEF/lacS双突变菌株。将报告质粒经电转化导入宿主菌后,就能通过测定转化子中表达的LacS蛋白的活性来确定启动子的强度。缺失突变实验结果表明araS启动子最短序列是从-55到+4（+1为转录起始位点）,并将此最短的araS启动子序列命名为ParaS。位于-49到-42之间的ara-box起转录激活功能,将其部分或者完全缺失之后,突变启动子在阿拉伯糖和葡萄糖培养基中都几乎完全失活。ara-box两侧的颠换突变结果表明这个回文序列的5’端和3’端序列都对启动子活性很重要,特别是3’端突变之后,在诱导条件下活性变为ParaS的4.1%到10.7%。并且将受阿拉伯糖诱导的基因（araDH、araD、dopDH和kdaD）的ara-box序列替换到ParaS中后,这些不同的ara-box序列都起到了转录激活作用。颠换突变结果表明BRE位点上的后四个碱基对启动子活性影响不大,而BRE靠近ara-box的两个碱基是araS启动子必需的。进一步序列分析表明,5个受阿拉伯糖诱导基因启动子的BRE位点不保守。TATA-box突变结果表明核心的"TTTATA" 6个碱基才是必需的,而3’端的AA却不是必需的。经过系统突变分析之后还在TATA-box下游-12到-7的位置发现一个A/T富集的araS启动子必需原件,特别是-7和-8位点,颠换造成ParaS活性降低到宿主菌本底水平,但是将-7/-8突变成“GG”或者“TT”只轻微地降低ParaS活性。并且推测通用转录因子TFB可能与这个启动子序列存在相互作用,因此将其名命名为BREdn （Downstream BRE）。同时,在转录起始位点（TSS）附近的+1、+2和+4位点的颠换突变严重影响lacS的表达,根据这个位点的位置将其命名为ParaS转录起始元件（Initiation Element）。在鉴定到5个启动子元件的基础上,我们在古菌中鉴定到一个新的转录激活机理。araS基本启动子序列在所有已检测的培养基中活性都很低,而加上ara-box序列（即ParaS）后,在上述各种培养基中都激活了转录,因此ara-box是一个在不同培养基条件下的通用的上游转录激活序列,具我们所知,这是在古菌中第一次发现一个启动子DNA调控元件在不同培养基中具有不同水平的通用转录激活功能。杂合启动子分析表明,ParaS的TATA-box及其3’端序列是具有活性的,而ParaS没有活性的原因是araS BRE没有活性。在ParaS中上游ara-box能够互补BRE的缺陷从而激活ParaS基本启动子的转录。因此结合ara-box激活转录的结果得出结论：由于BRE缺陷,TFB不能结合到ParaS上,ParaS受诱导激活转录是靠结合在ara-box上的转录激活蛋白集结（recruit） TFB到启动子序列,这是在古菌中发现的一个全新的转录激活机理。在ParaS和穿梭质粒的基础上,我们构建了一些列硫化叶菌表达载体,并且超表达了带有His标签的Mre11和RFC大亚基。电泳检测初步显示纯化的Mre11和RFCl足够用于体外生化分析和体内pull-down实验。在以Mre11为饵的体内pull-down实验中初步鉴定Mre11和RFC小亚基具有相互作用,进而在古菌中将DNA修复和DNA复制联系在一起。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 古菌简介
• 1.2 硫化叶菌简介
• 1.3 古菌启动子结构
• 1.4 古菌RNA聚合酶
• 1.5 古菌通用转录因子
• 1.5.1 TATA-box binding protein
• 1.5.2 转录因子B（TFB）
• 1.5.3 转录因子E（TFE）
• 1.6 古菌转录调控
• 1.7 古菌遗传操作体系
• 1.8 报告基因系统
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基配方及培养条件
• 2.3 主要分子生物学试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 硫化叶菌电转化
• 2.4.2 大肠杆菌DH5α热击转化法
• 2.4.3 构建载有ParaS缺失突变-lacS基因融合片段的报告质粒
• 2.4.4 在最短启动子序列中突变并克隆Sso3071启动子
• 2.4.5 构建杂合启动子
• 2.4.6 电泳迁移率变动实验（EMSAs）
• 2.4.7 磁性DNA亲和层析纯化调控蛋白
• 2.4.8 表达重组蛋白
• 2.4.9 构建硫化叶菌体内表达载体并表达Mre11、RFC大亚基和PolB1
• 2.4.10 SDS-PAGE和Western Blot
• 2.4.11 提取硫化叶菌总RNA
• 2.4.12 反转录实验
• 2.4.13 制备大肠杆菌DH5α感受态细胞和硫化叶菌E234感受态细胞
• 2.4.14 B-galactosidase （LacS）酶活分析
• 3 结果与分析
• 3.1 硫化叶菌阿拉伯糖操纵子结构
• 3.2 硫磺矿硫化叶菌中的araS启动子在冰岛硫化叶菌中控制D-阿拉伯糖诱导型表达
• 3.3 定义最短的具有野生型活性的araS启动子片段
• 3.4 在ara-box,BRE和TATA-box上突变鉴定到重要的碱基位点
• 3.5 鉴定到一个新的启动子元件
• 3.6 Initiation Element影响lacS表达
• 3.7 发现古菌中一个新的转录激活机理
• 3.8 硫化叶菌粗提液成分特异性地结合在含有ara-box序列的DNA探针上
• 3.9 DNA亲和层析纯化得到两个可能的调控蛋白
• 3.10 硫化叶菌表达载体及其应用
• 4 讨论
• 4.1 启动子元件及转录调控机理
• 4.2 转录调控蛋白
• 4.3 硫化叶菌表达体系
• 参考文献
• 附录
• 本研究所用引物
• 博士期间学术成果
• 致谢