cAMP反应元件结合蛋白介导磷酸化ERK1/2在癫痫苔藓纤维出芽中的作用及机制探讨

论文摘要

目的:观察细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,ERK1/2）信号转导通路抑制剂（U0126）对体外培养海马神经元癫痫样放电后磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response-element binding protein, pCREB）、生长相关蛋白（growth associated prorein,GAP-43）和突触体素（synaptophysin, SYP）表达变化的影响,探讨ERK/CREB转导通路在癫痫苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting, MFS）中的作用。方法:采用24 h内新生Wistar大鼠,海马神经元用含10%胎牛血清的Neurobasal培养液培养于37℃、5%CO2细胞培养箱。将细胞分为:1.正常对照组（control）:正常培养液培养至第9d时,换用正常细胞外液处理3h,运用膜片钳测定细胞活性;2.模型组（model）:将海马神经元培养至第9d时,将培养液换成无镁细胞外液处理3h,去标本运用膜片钳测定细胞放电情况,确定细胞癫痫样放电模型建立成功;3.U0126组:将海马神经元培养至第9d时,将培养液换成无镁细胞外液,同时加入10μm/l U0126,3 h后换成正常培养液。在模型组和U0126组中,分别取6个时间点（无镁细胞外液处理3h后0min,30min,2h,6h,12h和24h）的标本进行相应实验。采用免疫荧光双重标记各组中每个时间点的pERK1/2和pCREB的表达,并在激光共聚焦扫描显微镜下拍照。运用Western-blot检测不同时间点各组细胞GAP-43和SYP的表达水平。结果:1.运用EPC-10系统进行全细胞模式记录海马神经元癫痫样放电:正常对照组中,神经元培养至第9d时,换成正常细胞外液处理3h,显示神经元在多数时间内处于静息状态,偶尔出现动作电位;模型组中,神经元培养至第9d时,换成无镁细胞外液处理3h,神经元阵发性出现连续的稳定的l0～35mV动作电位,放电频率5～l7Hz,经无镁处理3h,换成正常维持培养基24h后,90%以上的神经元仍呈癫痫样放电。2.免疫荧光双重标记pERK1/2和pCREB的表达:在正常对照组中,可以观察到pCREB在神经元胞核内有轻度表达,pERK1/2主要在神经元胞浆内表达;模型组中,0min时,可以观察到pCREB在神经元胞核内表达,pERK1/2在神经元胞核与胞浆内皆有表达,30min时,两者的表达达到了高峰,2h时开始减弱,6h,12h和24h仍然有所表达,强度与2h时接近;U0126组中,各时间点的pERK1/2表达完全被抑制,pCREB的荧光强度绝对值与模型组中相应时间点的相比较明显减弱（均p <0.01）,并且各时间点的表达强度相近。3.Western-blot检测GAP-43和SYP的表达水平:GAP-43和SYP的表达趋势一样。在正常对照组中,发现GAP-43和SYP都有轻度表达;在模型组中,GAP-43和SYP在各个时间点的都有表达,30min时,表达达到高峰,与pERK1/2的表达趋势相似;在U0126组中,六个时间点的GAP-43和SYP表达强度与模型组中相应的时间点比较减弱明显（均p <0.01）,同时,该组中各时间点的表达强度相近。结论:1.通过Neurobasal培养液加胎牛血清所培养的海马神经元活性好,经无镁细胞外液处理3h后,所获得的神经元癫痫样放电模型是一种持续的稳定癫痫细胞模型,为今后进一步研究癫痫的发病机制提供了条件。2.海马神经元癫痫样放电后ERK/CREB信号转导通路明显被激活,同时反应突触可塑性的蛋白GAP-43和SYP的表达明显增强,此外,ERK1/2的特异性抑制剂U0126在阻断ERK/CREB信号转导通路的同时,明显减弱了GAP-43和SYP的表达, GAP-43和SYP是癫痫MFS的两大标记物,3.本研究在细胞水平上探讨了癫痫MFS和ERK/CREB信号转导通路之间的关系。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 论文正文：cAMP 反应元件结合蛋白介导磷酸化ERK1/2 在癫痫苔藓纤维出芽中的作用及机制探讨
• 前言
• 第一部分 海马神经元培养与鉴定及其癫痫样放电模型的建立
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二部分 cAMP 反应元件结合蛋白介导磷酸化ERK1/2 在癫痫苔藓纤维出芽中的作用机制探讨
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文