AFP启动子慢病毒载体的构建及人胎肝干细胞研究

论文摘要

世界上对干细胞的研究已有多年的历史,它已经成为当今生命科学研究的前沿之一。当前,由于各种肝病患者不断增长和肝脏捐献器官来源的缺乏,对肝干细胞的研究已经成为热点,这将有助于更好的了解许多肝脏疾病的产生机理和可能的治疗途径,而胎肝是研究肝干细胞很好的实验材料。本文通过以下三个方面对胎肝细胞的分离,培养,体外诱导分化及体内移植进行了研究: 1 将慢病毒载体plv的CMV启动子替换为人基因组AFP启动子,使该病毒感染胎肝细胞后,在AFP阳性细胞中表达绿色荧光蛋白,从而可利用流式细胞仪分选出表达AFP即GFP阳性的胎肝细胞。该标记筛选系统的建立为进一步研究胎肝细胞的生物学特性和肝干细胞的分离和应用奠定了良好的基础。 2 为了得到大量用于临床治疗和科学研究的细胞,仅靠分离原代细胞,不仅无法得到细胞量的保障,而且样品不稳定,费用昂贵。解决该问题最好的方法就是建立稳定的原代细胞系,但通常原代分离胚胎来源的细胞在培养一段时间后会分化,增殖能力逐渐减弱直到停止分裂。通过两种方法来建立胎肝来源的细胞系:分离胎肝细胞挑取细胞克隆,与饲养层细胞共培养来建立细胞系;分离胎肝细胞并稳定转染hTERT端粒酶基因,使之永生化。 3 为了研究分离的胎肝细胞的分化潜能,将其移植到免疫缺陷鼠体内,经检测发现它能够分化为多个组织的细胞。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 肝脏干细胞研究
• 2.1 肝脏干细胞
• 2.2 胚胎肝干细胞
• 第二章 AFP启动子慢病毒载体构建以及 AFP阳性人胎肝细胞的筛选
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 质粒
• 2.2 细胞
• 2.3 试剂
• 2.4 载体构建
• 2.5 细胞培养
• 2.6 细胞转染
• 2.7 病毒感染
• 2.8 流式分选
• 2.9 流式检测
• 3 结果与分析
• 3.1 载体构建
• 3.2 细胞分选与检测
• 4 讨论
• 第三章 建立人胎肝细胞的永生化细胞系
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 质粒
• 2.2 细胞
• 2.3 试剂
• 2.4 实验动物
• 2.5 细胞培养
• 2.6 脂质体转染
• 2.7 病毒感染
• 2.8 挑取单克隆细胞
• 2.9 流式细胞检测
• 2.10 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.11 裸鼠成瘤实验
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 人胎肝细胞的体内移植与检测
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 细胞
• 2.2 试剂
• 2.3 细胞培养
• 2.4 实验动物
• 2.5 药物损伤
• 2.6 细胞移植
• 2.7 冰冻切片
• 2.8 免疫组织化学
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢