羟基红花黄色素A和一氧化氮对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制探讨

论文摘要

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是指缺血期处于可逆损伤的心肌细胞恢复血液供应后产生更为严重的损伤.随着冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉内成形术等血管再通术的迅速开展,冠心病再灌注治疗出现了一个飞跃。但MIRI也成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法获得最佳疗效的主要难题,如何减轻MIRI成为医学界新的挑战。线粒体通透性转换孔（MPTP）是线粒体内膜上的无选择性通透孔。在生理条件下,Ca2+和活性氧组分（ROS）均是MPTP开放最重要的诱导者。而自由基的产生和钙超载是MIRI的主要原因,研究表明MPT的抑制剂能阻止再灌注的心肌细胞的坏死和凋亡。实验表明,NO有较强的清除自由基作用,同时细胞内NO能降低心肌细胞内钙浓度,减轻钙超载,进而达到抗MIRI的作用。环孢素A（CsA）是最有效的MPTP开放抑制剂之一,对再灌注损伤的具有保护作用。红花为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花,有效主要成分集中在水溶性的黄色素部分,而在红花黄色素中含量最高且具有活性的成分为HSYA。研究表明,HSYA可浓度依赖地抑制血小板活化因子（PAF）与家兔洗涤血小板（WRP）受体的结合;还能抑制PAF介导的WRP与兔多型核白细胞（PMNs）的聚集。HSYA可以减轻大鼠压力超负荷所致的心肌肥厚,并能通过调节一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的活性减少心肌梗死面积并保护缺血心肌。最近有报道HSYA可通过抗氧化作用保护脑缺血/再灌注（I/R）损伤。但HSYA是否能够保护心脏/再灌注损伤及其作用机制仍未明确。再灌注损伤营救激酶（reperfusion injury salvage kinase,RISK）途径是指在再灌注期间发挥抗细胞死亡心脏保护作用的磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）-Akt和细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2）前生存激酶的信号级联。再灌注早期RISK途径的激活可通过各种抗凋亡机制减轻再灌注损伤。研究表明,多种预适应方法和后处理能够减轻再灌注损伤,而且这种保护作用与上述生存信号通路的活化相关。本实验通过对HSYA抗心肌缺血再灌注损伤作用及机制的研究,着重探讨了NO与MPTP调节的关系,并观察了HSYA对Akt和ERK1/2活性的影响。方法:1.NO对线粒体通透性转换的影响采用离体大鼠心脏灌流方法,全心停灌30min和复灌120min模拟缺血/复灌损伤,测定心肌梗死面积、冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量。提取大鼠心肌线粒体,分光光度法测定钙诱导下520nm吸光度的改变。分离心肌细胞缺氧/复氧模型测定心肌细胞线粒体膜电位。2.HSYA抗缺血再灌注损伤的作用及其线粒体机制的研究采用离体大鼠心脏灌流方法,全心停灌30min和复灌120min模拟缺血/复灌损伤,测定心肌梗死面积、冠脉流出液中LDH含量。提取大鼠心肌线粒体,分光光度法测定钙诱导下520nm吸光度的改变。分离心肌细胞缺氧/复氧模型测定心肌细胞线粒体膜电位。Western blot测定缺血区心肌组织eNOS、p-eNOS蛋白的表达水平。3.HSYA对大鼠缺血再灌注PI3K-Akt和ERK1/2通路的影响采用离体大鼠心脏灌流方法,全心停灌30min和复灌120min模拟缺血/复灌损伤,Westem blot测定缺血区心肌组织在复灌不同时间点Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达水平。同时观察不同浓度HSYA对Akt、p-Akt蛋白表达水平的影响。结果:1.NO对线粒体通透性转换的影响I/R组心脏缺血30min、复灌120min后,梗死面积（梗死区占危险区面积比值）为（46.55±3.61）%。与I/R组相比,CsA（0.2μmol/L）预处理组心肌梗死面积明显减小,复灌期间冠脉流出液中LDH含量降低。L-NAME（10μmol/L）明显减弱CsA降低梗死面积和复灌期间冠脉流出液LDH的释放的作用。用CsA预处理线粒体后再加入200μmol/L CaCl2,A520下降不明显。CsA可阻止△ψm去极化.CsA+L-NAME组TMRE荧光增强,F/F0增高,促进其去极化。2.HSYA抗缺血再灌注损伤的作用及其线粒体机制的研究与I╱R相比HSYA治疗组（0.05,0.1和0.2mmol/L）心梗面积显著减少,并且LDH水平显著下降。20umol/L MPTP的开放剂atractyloside（Atr）可明显抑制HSYA的心肌保护作用（46.12±4.32%）。NOS抑制剂L-NAME（10umol/L）可部分抵消HSYA对梗塞面积和LDH释放的保护作用,促进线粒体△ψm去极化。0.1mmol/L HSYA能够抑制线粒体在A520处吸光度的下降,并阻止其△ψm的去极化。与对照组相比,0.1mmol/L的HSYA组eNOS的磷酸化水平显著增高,而L-NAME可抑制其作用。3.HSYA对大鼠缺血再灌注PI3K-Akt和ERK1/2通路的影响HSYA组中Akt的表达水平与对照组比较无显著性差异,但p-Akt的表达明显增加,再灌注0,5,10min与对照组各时间点比较p-Akt分别增加了1.9倍、2.5倍和4.3倍。HSYA组在再灌注0,5,10min ERK1/2的表达水平与对照组中无显著性差异（P＞0.05）,而且p-ERK1/2表达水平与对照组相比也无显著性差异（P＞0.05）。结论:1.NO机制参与阻止心肌缺血再灌注时MPTP的开放;2.HSYA具有抗心肌缺血/复灌损伤的保护作用;3.HSYA抗心肌缺血/复灌损伤的作用机制可能与通过P13K/Akt信号通路,活化eNOS,增加NO生成,从而抑制线粒体渗透性转换孔的开放有关。4.在心肌缺血再灌注早期,HSYA对ERK1/2通路无影响。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 NO对线粒体通透性转换的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 HSYA对心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制的探讨
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 HSYA对缺血再灌注心肌PI3K-Akt和ERK1/2通路的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 综述 心肌缺血再灌注损伤研究进展
• 在读期间发表的论文相关文章
• 致谢