电分析化学方法用于水体中大肠杆菌快速检测的应用研究

论文摘要

大肠杆菌是水体污染程度的重要指示菌,是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌。当大肠杆菌由粪便尤其是肠道病患者粪便或医院污水污染的水源排放后,它可引发伤寒、痢疾、霍乱等肠道疾病流行。根据报道,全球每年因感染致病性大肠杆菌至少可导致6.5亿人发病,并引起约80万5岁以下儿童死亡,在我国不少地区大肠杆菌在腹泻病人的病原谱中也占首位。大肠杆菌在水体中不仅存在的数量与肠道疾病呈现一定的相关性,而且它的抗逆性也很强,因此存在于溪流、河水、湖泊等与人类生活密切相关的环境中的大肠杆菌已经成为人类病原存在的一个重要指标,成为环境保护、食品卫生、饮水卫生和流行性病学领域中最重要的研究对象之一。随着社会经济的发展和环境问题的突出,美国、欧洲、日本等一些国家和地区先后制订了总大肠杆菌条例,我国也在1997年5月在全国建立了大肠杆菌检测网络,卫生部在2002年4月也制订了大肠杆菌O157∶H7感染性腹泻应急处理方案。这些措施的实施对人体健康和经济发展具有十分重要的意义,而对大肠杆菌有效和快速的检测是这些工作得以顺利进行的前提和关键。大肠杆菌的常规检测方法主要包括多管发酵法、滤膜法、荧光法、生物检测法等,常规方法是目前国内大多数检测机构使用的方法。但是这些常规检测方法要求条件很高,要求水样采集后立即检测,一般不超过4小时,即使储存于冰箱中,也不得超过24小时,水样中的大肠杆菌过多或过少都可能影响正确的检测,再加上传统方法检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点,这些技术已经不能满足现代检测需要,虽然有厂家推出了大肠杆菌测定仪,但是测定所需时间也在24小时以上,况且样品的预处理程序比较复杂。从我们所查到的资料看,目前还没有一种方法能够对大肠杆菌进行快速计数,这也严重影响了人们对大肠杆菌传染源的判断和防治,因此,快速计数大肠杆菌的研究对环境卫生以及流行病学等方面都具有十分重要的意义。目前主要发展了化学发光和荧光法,酶分析方法、免疫分析法、电化学安培法以及生物和化学传感器方法,另外电泳和毛细管柱也开始在此领域应用。JaapS.Sinninghe Damste,J.Rishpon和Jinghong Li等人在细菌的检测等方面曾做过不少工作,但这些方法对低浓度细菌的检测还有欠缺,而且这些新方法的成本较高,方法本身的操作难度较大,难于实现智能化和仪器化。本论文的工作主要集中在将纳米技术、电化学分析技术和传感器制备技术相结合,开发了新型的电分析化学方法用于快速计数水体中的大肠杆菌。论文重点研究了纳米修饰电极用于流动注射分析中对大肠杆菌的快速计数及其检测的作用机理,制备了免疫传感器实现了对水体中大肠杆菌的快速检测,而且首次制备了海藻酸包裹钴的磁性高分子微球并将其用于大肠杆菌的基因片断的检测,为实际水体样品中大肠杆菌的检测提供了广泛的前景。具体研究内容如下:1基于IrO2-Pd纳米修饰电极流动注射安培分析快速检测水体中大肠杆菌的研究本文制备了IrO2-Pd纳米修饰电极,利用流动注射-安培检测方法,开展了水体中大肠杆菌的快速计数研究。在异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导作用下,大肠杆菌体内产生β-D-半乳糖苷酶。通过膜渗透剂PBN和溶菌酶Lvsozyme对大肠杆菌细胞膜壁的作用,β-D-半乳糖苷酶从细胞体内释放出来,催化水解大肠杆菌培养介质中的底物4.氨基酚-β-D-吡喃半乳糖（PAPG）产生4-氨基酚,而4-氨基酚的量与溶液中大肠杆菌的量成线性关系,通过检测溶液中4-氨基酚的量就可以实现对大肠杆菌的快速计数。为了提高检测大肠杆菌的灵敏度,本文制备了IrO2-Pd纳米修饰电极作为流动注射—安培检测的电化学检测器。实验结果表明,大肠杆菌浓度在2.0×102～1.0×106 cfu/mL范围内时,响应电流与大肠杆菌的数量有很好的线性关系,大肠杆菌的检测限为150 cfu/mL,整个实验所需要的时间为3小时。2电化学免疫传感器的制备及其用于水体中大肠杆菌的检测本文成功地实现了电化学免疫传感器用于水体中大肠杆菌的快速检测。文中以金电极为工作电极,利用巯基物质在金表面的自组装特性,在金表面形成稳定、有序、紧密的尾基为羧基的巯基乙酸（MACA）自组装膜（Self-assembledMonolayers,SAMs）,再利用偶联剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的活化作用形成活性中间体,使抗体更有效的固定在自组装膜上。实验表明EDC与NHS的偶联增强了抗体连接在电极上的稳定性,并大大提高了抗体在自组装膜上的浓度,从而使免疫传感器的灵敏度及精确度有了明显的提高。在存在铁氰化钾/亚铁氰化钾氧化还原对的缓冲溶液中,测量电极经各步处理后的循环伏安曲线和电化学阻抗谱。循环伏安曲线可用来定性的分析电极表面的修饰状况以及修饰层的稳定性。根据电化学阻抗谱良好的界面表征特性,电子转移电阻的改变最明显,增幅最大。从而可以确定,免疫传感器的修饰以及大肠杆菌的固定主要影响了电子转移阻抗。由于抗体抗原的特异性结合,通过分析在不同浓度大肠杆菌溶液中电子转移阻抗的变化,实现了对大肠杆菌的定量分析。实验结果表明,大肠杆菌浓度在3×103～3×107cfu/mL范围内的对数值与溶液中的电子传递阻抗呈线性关系,检测限为1×103cfu/mL。通过富集和浓缩过程,此方法用于地表水中大肠杆菌数目的检测,可检测至50cfu/mL。3基于磁性纳米颗粒的DNA电化学生物传感器用于水体中大肠杆菌检测的研究本文研制了具有高灵敏度和高选择性的基于磁性高分子微球的电化学DNA生物传感器,并将其用于大肠杆菌的检测。以海藻酸包裹钴的磁性高分子微球作为DNA探针的固体基质,根据大肠杆菌细胞体内uid A基因合成了特异性的DNA序列,制备了用于大肠杆菌检测的DNA探针。杂交过程中对嵌入式杂交指示剂柔红霉素在杂交前后分别进行电化学检测,由杂交前后电化学信号的变化即可实现对大肠杆菌的检测。文中利用透射电镜（TEM）技术对制备的磁性高分子微球进行了表征,并用红外光谱证实了特定序列DNA片断与磁性高分子微球的成功连接。并且我们还利用非互补DNA序列、三个碱基错配的DNA序列及完全互补序列验证了文中制备的DNA探针的选择性。此外,我们利用完全互补DNA序列对杂交反应的时间、温度及离子强度进行了条件优化。此电化学DNA生物传感器还可应用于实际样品的检测,实验过程中聚合酶链反应（PCR）技术被用来提取大肠杆菌uid A基因片断,我们试验了此电化学DNA生物传感器对经过热处理后的PCR产物和大肠杆菌细胞的检测。结果表明,本文研制的电化学DNA生物传感器可检测完全互补序列3×1010mol/L,PCR产物0.5ng/uL,大肠杆菌细胞50cells/mL。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.大肠杆菌的生物学特性
• 2.大肠杆菌检测方法的研究现状
• 3.本论文中大肠杆菌检测技术的原理及应用
• 3.1 纳米氧化物电极
• 3.2 免疫传感器
• 3.3 电化学DNA生物传感器
• 4.本论文的工作及意义
• 参考文献
• 2-Pd纳米修饰电极流动注射安培分析快速检测水体中大肠杆菌的研究'>第二章 基于IrO₂-Pd纳米修饰电极流动注射安培分析快速检测水体中大肠杆菌的研究
• 1.引言
• 2.实验部分
• 3.结果与讨论
• 3.1 纳米修饰电极的表征
• 2-Pd纳米修饰电极上的循环伏安图'>3.2 4-氨基酚在IrO₂-Pd纳米修饰电极上的循环伏安图
• 3.3 大肠杆菌检测机理
• 3.4 实验最优条件选择
• 3.5 大肠杆菌的检测
• 3.6 其他细菌的干扰性实验
• 4.结论
• 参考文献
• 第三章 电化学阻抗谱免疫生物传感器检测大肠杆菌的研究
• 1.引言
• 2.实验部分
• 3.结果与讨论
• 3.1 免疫传感器的制备
• 3.2 免疫传感器的原子力显微镜（AFM）表征
• 3.3 循环伏安法表征免疫传感器层层自组装过程
• 3.4 活化时间的最优化选择
• 3.5 抗体与大肠杆菌细胞的最优免疫反应时间选择
• 3.6 电化学阻抗法检测大肠杆菌
• 3.7 其它微生物的干扰性实验
• 3.8 地表水中大肠杆菌的检测
• 4.结论
• 参考文献
• 第四章 基于磁性高分子微球的电化学DNA生物传感器用于大肠杆菌检测的研究
• 1.引言
• 2.实验部分
• 3.结果与讨论
• 3.1 磁性高分子微球及DNA探针的表征
• 3.2 DNA电化学检测机理
• 3.3 DNA杂交条件的优化
• 3.4 基于磁性高分子微球的DNA探针的选择性研究
• 3.5 DNA探针用于特定DNA序列的电化学定量检测
• 4.结论
• 参考文献
• 附录:硕士在读期间科研成果
• 致谢