传染性法氏囊病病毒VP5缺失减毒株的构建

论文摘要

传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害3-8周龄雏鸡的中枢免疫器官法氏囊,破坏带有sIgM的B淋巴细胞,引起脾脏、胸腺及外周血液淋巴细胞的凋亡,导致以淋巴细胞衰竭坏死为主要特征的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病。 通过易感动物雏鸡,构建了一株传染性法氏囊病病毒基因组节段杂合病毒。应用PCR定点突变方法,在IBDV野毒株ZJ2000株A节段2366-2371nt引入沉默突变NaeI后,克隆入真核表达载体pCI,获得pCI-AKZJ2000,分别制备pCI-AKZJ2000、以及含有细胞致弱疫苗株HZ2株A和B节段全长的真核表达载体pCI-AKHZ2和pCI-mBHZ2的超纯质粒。不同组合的上述质粒（pCI-AKZJ2000/pCI-mBHZ2和pCI-AKHZ2/pCI-mBHZ2）,在脂质体介导下,肌肉途径分别注射雏鸡。通过血清抗体、病毒抗原和病毒粒子检测、鸡胚传代试验、以及分子遗传标记鉴定,表明从鸡体内拯救出了杂合病毒rAKZJ/HZ和重组病毒Xihu2002株。本试验为IBDV的反向遗传系统提供了一个新策略,尤其是对于不能适应细胞的IBDV强毒株的拯救。结果还提示IBDV基因组B节段序列对病毒毒力具有重要作用,为研究VP1蛋白在病毒复制和致病中的作用提供了思路。 制备了兔抗IBDV VP5多克隆抗体。利用RT-PCR技术从IBDV地方分离株TL2004株感染鸡胚尿囊液中扩增到VP5基因,进而构建了T7启动子控制下的N端GST-Tag融合表达质粒pGEX-VP5。序列测定表明VP5基因全长438bp,编码一个由145个氨基酸组成的VP5蛋白。将pGEX-VP5转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下高效表达了GST-VP5融合蛋白（44kD）。通过包涵体纯化的方法,获得的较高纯度的融合蛋白,免疫新西兰兔,Western blot和ELISA分析表明,制备的融合蛋白抗血清效价在1:12800以上,并具有良好的免疫反应性,为进一步研究VP5在IBDV复制与致病中的作用,以及IBDV VP5基因缺失病毒打下了良好的基础。 在上述基础上,进而探索了VP5基因序列及编码蛋白对IBDV复制的影响。通过PCR定点突变方法,将IBDV HZ2株A节段ORF A2（VP5）起始密码子

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 综述
• 第一章 传染性法氏囊病病毒的分子生物学基础
• 1 IBDV的基因组结构及编码的蛋白
• 1.1 5’-NCR和3’-NCR
• 1.2 病毒的蛋白
• 1.2.1 VP1蛋白
• 1.2.2 VP2蛋白
• 1.2.3 VP3蛋白
• 1.2.4 VP4蛋白
• 1.2.5 VP5蛋白
• 2 IBDV的形态和结构
• 3 IBDV抗原与毒力变异的分子机制
• 4 IBDV的复制和繁殖
• 第二章 动物DSRNA病毒的反向遗传系统
• 1 动物dsRNA病毒科的反向遗传
• 1.1 dsRNA病毒科反向遗传系统的建立
• 1.2 反向遗传系统在dsRNA病毒科病毒研究中的应用
• 1.3 反向遗传系统对dsRNA病毒科病毒VP5蛋白研究的意义
• 2 呼肠孤病毒科（Reoviridae）的反向遗传
• 2.1 呼肠孤病毒科反向遗传的探索
• 2.2 S2基因末端序列对呼肠孤病毒科复制的意义
• 3 展望
• 第二部分 研究内容
• 第三章 基因组节段杂合传染性法氏囊病病毒的构建—基于易感动物
• 1 材料和方法
• 1.1 内切酶和试剂
• 1.2 定向克隆
• 1.3 IBDV ZJ2000株基因组A节段定点突变引入NaeI酶切位点
• 1.4 含有突变A节段的真核表达载体的构建
• 1.5 转染级高纯质粒的制备及动物实验
• 1.6 Lipofectamine复合物制备及动物实验
• 1.7 ELISA血清抗体的检测
• 1.8 法氏囊的病理组织学观察
• 1.9 琼脂免疫扩散试验检测IBDV抗原和电镜观察病毒粒子
• 1.10 杂合病毒的鸡胚增殖试验
• 1.11 杂合病毒基因组抽提
• 1.12 Long-accurate RT-PCR扩增基因组并酶切鉴定
• 2 结果
• 2.1 含有分子标记的基因组A节段真核表载体的构建
• 2.2 共注射感染性克隆，诱导了高效价的抗IBDV血清抗体
• 2.3 临床观察和法氏囊病理组织学检查
• 2.4 IBDV抗原检测和IBDV病毒样粒子观察
• 2.5 杂合病毒的鸡胚感染实验
• 2.6 杂合病毒基因组分子标记的鉴定
• 3 讨论
• 第四章 传染性法氏囊病病毒VP5基因的原核表达及多克隆抗体制备
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 病毒增殖及基因组RNA的抽提
• 1.3 VP5基因的RT-PCR扩增和原核表达载体的构建
• 1.4 VP5蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化
• 1.4.1 GST-VP5融合蛋白的诱导表达
• 1.4.2 免疫印迹（western blot）
• 1.4.3 GST-VP5融合蛋白的纯化
• 1.5 兔抗VP5蛋白多克隆抗体的制备
• 2 结果
• 2.1 IBDV TL2004株VP5基因原核表达载体的构建和序列分析
• 2.2 VP5蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
• 2.3 兔抗VP5蛋白多克隆抗体鉴定和效价测定
• 3 讨论
• 第五章 传染性法氏囊病病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒、质粒与细胞培养
• 1.2 试剂与引物
• 1.3 过渡载体pGEX-4T-2-A／HZ2的构建
• 1.4 感染性克隆突变体的构建（Fig.1）
• 1.5 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备
• 1.6 共转染与“病毒传代”
• 1.7 间接免疫荧光检测病毒结构蛋白和非结构蛋白
• 1.8 电子显微镜观察病毒样粒子
• 1.9 RT-PCR扩增病毒基因组RNA和分子标记鉴定
• 1.10 50％细胞感染量（TCID50）滴定试验
• 1.11 生长曲线试验
• 1.12 ELISA半定量病毒结构蛋白表达
• 2 结果
• 2.1 pGEX-A／HZ2的构建
• 2.2 感染性克隆突变体的构建
• 2.3 细胞病变的观察与病毒“感染”
• 2.4 间接免疫荧光试验显示VP5蛋白不被表达
• 2.5 电子显微镜观察病毒样粒子
• 2.6 RT-PCR扩增病毒基因组RNA和分子标记鉴定
• 2.7 生长曲线
• 2.8 ELISA法检测病毒蛋白表达动态
• 3 讨论
• 第六章 传染性法氏囊病病毒ANHE2株的感染性和免疫原性研究
• 1 材料
• 1.1 SPF来航鸡胚和SPF来航鸡
• 1.2 免疫用IBDV病毒株
• 1.3 IBDV标准强毒株
• 1.4 病毒血清中和试验用毒株
• 2 方法
• 2.1 IBDV ANhe2株在SPF鸡体内的复制特性
• 2.1.1 动物分组及病毒接种
• 2.1.2 囊／体比值计算
• 2.1.3 法氏囊病理解剖学和病理组织学检查
• 2.1.4 病毒分离和滴定
• 2.1.5 分离病毒的遗传标记检测
• 2.2 IBDV ANhe2株的免疫特性
• 2.2.1 动物分组
• 2.2.2 血清ELISA抗体检测
• 2.2.3 血清中和抗体检测（固定病毒稀释血清法）
• 2.2.4 法氏囊病理学观察及统计学分析
• 3 结果
• 3.1 VP5的缺失对IBDV ANhe2株在SPF鸡体内复制的影响
• 3.1.1 法氏囊病理解剖学和病理组织学检查
• 3.1.2 病毒在法氏囊中的感染曲线
• 3.1.3 病毒在法氏囊中复制的遗传稳定性
• 3.2 VP5的缺失对IBDV ANhe2株诱导机体保护性免疫的影响
• 3.2.1 攻毒保护试验
• 3.2.2 血清抗体的检测
• 4 讨论
• 第七章 总结和展望
• 1 主要结论与创新点
• 2 展望与不足
• 参考文献
• 第三部分 附录
• 独创性声明