论文摘要
由于自然灾害、交通意外、疾病等原因造成骨缺损的患者十分常见,这些缺损畸形严重影响患者的外形美观和机体功能,需要选择合适的骨修复材料加以治疗。骨缺损的修复是临床工作的一项重要内容。目前临床上广泛使用自体骨,异体骨和异种骨移植等方法修复骨缺损,然而这几种方法各有弊病,限制了它们的使用。近年来,组织工程骨因为其设计和制造的基本原则贯彻了骨缺损的仿生修复理念,成为骨缺损修复领域的研究重点之一。骨组织工程研究中的重点和难点是支架的构建,即支架基体材料的选择和支架的成型。人工合成材料具有来源不受限制,可以规模生产等优势,成为支架材料基体的重要来源。对于支架的成型工艺,目前的研究趋势是以骨缺损区的骨质结构为模板,将两种或两种以上性能互补的生物可降解材料按照一定配比进行复合,构建出具有良好的三维结构和成骨活性的骨组织工程支架。选择适合的支架基体、改良支架成型工艺等手段都有可能构建出更好的骨组织工程支架。这也是本研究的重点所在。本研究拟评价短棒状羟基磷灰石的细胞毒性,并以其为基体,先与PLGA复合构建外支架,然后再将胶原和BMP注入外支架,冷冻干燥成型内支架,构建羟基磷灰石基仿生组织工程骨双层复合支架（下文中简称HA基支架材料）,并负载种子细胞检测其成骨能力,希望构建出一种结构和功能仿生、成骨性能良好的骨组织工程支架。基体材料羟基磷灰石的主要缺点是降解性能较差,掺锶后可能具有更好的成骨活性和降解性能。通过对新型梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥进行检测与筛选,寻找成骨活性和降解性能更好的羟基磷灰石替代品。1.短棒状纳米羟基磷灰石的细胞毒性检测目的:体外实验研究短棒状纳米羟基磷灰石（Na-HA）的细胞毒性。方法:采用MTT检测法,将不同浓度的短棒状Na-HA浸提液与L-929成纤维细胞接触1、3、5d,检测细胞增殖活性并计算细胞相对增殖率,6级毒性分类法评级,并进行形态学观察。用碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒检测浸提液对兔成骨细胞功能表达的影响。结果:不同时间点用不同浓度浸提液培养的细胞均正常增殖,毒性0～1级。浸提液不影响兔成骨细胞的功能表达。结论:短棒状Na-HA无细胞毒性,不影响成骨细胞的成骨活性。2.二次成型法构建HA基支架材料目的:探讨采用二次成型的方法构建HA基支架材料的可行性,并对材料的基本性能进行测试与分析。方法:采用快速成型技术构建组织工程骨支架负型,将HA粉末与PLGA复合注入成型外支架。溶解去除负型,再加入rhBMP-2、Ⅰ型胶原溶液,冷冻干燥成型内支架。对材料进行镜下观察,并通过三点弯曲加载方法测量抗折强度和抗压强度,排水法测定孔隙率。结果:采用二次成型技术成功构建HA基支架材料,结构仿生,抗折强度为5.46±1.22 Mpa,抗压强度为1.35±0.79 Mpa,孔隙率为73.8±3.2%。结论:按照设计要求制作了HA基支架材料,性能满意。3.HA基支架材料负载种子细胞的成骨活性检测目的:对比观察负载/未负载种子细胞的HA基支架材料的异位成骨性能和负载种子细胞的HA基支架材料对犬下颌骨30mm节段性缺损的修复能力。方法:自体BMSCs诱导的成骨细胞作为种子细胞,细胞悬液滴注法将支架与种子细胞复合,分别将负载/未负载种子细胞的HA基支架材料植入新西兰兔背部肌袋内,术后8周通过大体、组织学观察来研究其异位成骨能力。骨缺损修复实验中,先将HA基支架材料加工成3.0 cm×2.0 cm×1.0cm的长方体状,然后体外培养犬髂骨来源的BMSCs,经过BrdU标记及成骨诱导后,负载于HA基支架材料表面及内部,置入生物反应器旋转灌注培养,细胞膜片包裹后植入犬下颌骨30 mm长的节段性缺损。6个月后,通过影像学和组织形态学观察修复骨缺损的能力,免疫组化法检测种子细胞的归宿。结果:异位成骨实验中,8周时单纯HA基支架材料在肌袋内有少许骨质形成,负载种子细胞的HA基支架材料有较成熟的骨质形成,材料部分吸收。犬下颌骨缺损修复实验术后6个月,负载种子细胞的HA基支架材料完全修复犬下颌骨缺损,外形恢复良好,大量成熟的骨组织充满缺损区的全层,材料大部分被吸收。免疫组化染色结果显示缺损区细胞来源于自体BMSCs诱导的成骨细胞。负载种子细胞的HA基支架材料的骨缺损修复效果与自体髂骨移植效果相似。结论:HA基支架材料负载种子细胞后具有良好的异位成骨能力,该支架材料与自体BMSCs诱导的成骨细胞复合可以修复犬下颌骨30 mm节段缺损。4.梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥（Sr-HAC）的高温热稳定性检测和pH值稳定性观察目的:探讨水化方法合成梯度掺锶羟基磷灰石（Sr-HAC）的高温热稳定性和仿生理条件下的pH值稳定性。方法:水化方法制备梯度材料,将材料高温煅烧后使用XRD、IR与TEM等方法检测其高温热稳定性。梯度材料在培养液中浸泡并及时换液,置于孵箱中,不同时间点测量梯度材料的pH值。结果:同一制备条件及相同非理想化学计量配比下,Sr-HAC的高温热稳定性不如纯磷灰石,且分解产物磷酸三钙锶（Ca, Sr）3（PO4）2)的相变温度低于纯磷酸三钙。掺锶量愈多,其分解产物磷酸三钙锶中掺锶量也越多。随加热温度升高,Sr-HAC与纯磷灰石晶粒均逐渐长大。不同时间点测量在培养液中浸泡的材料pH值均稳定呈现弱碱性。结论:同一水化制备条件下,非理想化学计量配比Sr-HAC的高温热稳定性不如纯磷灰石,限制了材料的应用领域。Sr-HAC的pH值稳定呈现弱碱性,有利于成骨和内环境的稳定。5.梯度Sr-HAC的生物相容性评价及生物学筛选目的:研究梯度Sr-HAC的生物相容性及其与掺锶量的关系,并筛选出其中生物相容性和降解性能最好的组分用于组织工程骨支架的构建。方法:对梯度Sr-HAC进行了体外细胞毒性实验,急性全身毒性、热原性、溶血性实验和体内肌袋埋置、骨贴附实验,以及成骨细胞在材料表面的黏附、增殖和表达实验。通过上述实验测试梯度Sr-HAC的生物相容性,成骨细胞毒性,生物降解潜能及其与掺锶量的关系。结果:梯度Sr-HAC生物相容性良好,无成骨细胞毒性,急性全身毒性、热原性和溶血性测试均为合格,与掺锶量呈非线性关系。成骨细胞在其表面粘附良好,增殖活跃,材料部分降解。埋植于肌袋的材料被薄层纤维组织包绕,随着观察时间的延长,0% Sr-HAC组仍然极少降解,5%Sr-HAC、10% Sr-HAC组部分降解。骨贴附实验中材料与骨组织相容性良好,5% Sr-HAC、10% Sr-HAC组更加有利于新骨的长入和材料的降解吸收。结论:梯度Sr-HAC体外细胞生物相容性良好,可以用于骨组织工程研究。综合分析实验结果,掺锶量为5%的Sr-HAC生物学性能最好,与纯羟基磷灰石相比降解性能提高,更加适合于骨组织工程的研究。各梯度Sr-HAC均无异位成骨能力。