论文摘要
IL-33（inteleukin 33,IL-33）作为IL-1家族的一员,与其特异性受体ST2结合,参与固有免疫和获得性免疫。IL-33主要通过促进Th2细胞免疫反应,在自身免疫疾病、变态反应性疾病、心血管疾病和神经退行性疾病等的发生发展中起重要的作用。慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases,COPD）是一组以肺实质与小气道受到病理损害后,导致慢性不可逆性气道阻塞、呼气阻力增加、肺功能不全为共同特点的肺疾病的总称。吸烟是COPD发病的重要因素。为了研究IL-33下调对相关炎症反应的影响,本研究应用RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）特异性下调小鼠IL-33 mRNA和蛋白的表达,探讨IL-33下调在吸烟诱导的小鼠急性肺炎模型中的作用。研究内容如下:一、根据GenBank中小鼠IL-33 mRNA序列（AY905582）,按照RNA干扰序列设计原则,运用GenScript公司的siRNA design center siRNA Target Finder设计针对小鼠IL-33的小干扰RNA（small inteference RNA, siRNA）,同时加入酶切位点XhoI和MluI,由上海生工生物工程有限公司合成编码siRNA序列的DNA单链。二、运用基因克隆技术,将化学合成的靶向小鼠IL-33基因的短发卡RNA（small hairpin RNA, shRNA）,与逆转录病毒载体pRNATin-H1.4/Retro连接。经测序鉴定,重组载体中插入的shRNA序列和设计序列一致,证明我们成功构建了小鼠IL-33 RNAi逆转录病毒载体。空逆转录病毒载体作为阴性对照,经脂质体Lipofectamine2000转染病毒包装细胞PT67,并以潮霉素B（Hygromycin B）筛选得到稳定转染细胞系,收集、保存病毒上清。三、收集的病毒上清经尾静脉注射作用于实验小鼠。应用反转录聚合酶链反应技术（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）检测IL-33 mRNA（ messenger RNA,mRNA ）在肺组织的表达,应用免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）检测IL-33蛋白的表达。RT-PCR和免疫组织化学法结果显示我们构建的重组逆转录病毒载体pRNATin-H1.4-IL-33a和-33b均可有效沉默小鼠肺组织中IL-33 mRNA和蛋白的表达,并且RT-PCR结果显示pRNATin-H1.4-IL-33a的沉默效果更为显著,为以后研究IL-33在相关疾病中的作用提供了可行方法。HE染色结果显示,IL-33干扰处理组的小鼠肺组织炎症病理改变有所减轻,为研究IL-33在COPD中的作用提供了有用的实验证据。总之,在本研究中,我们成功构建了针对小鼠IL-33的RNAi逆转录病毒表达载体,转染病毒包装细胞PT67并筛选获得稳定转染细胞系,经动物实验证实,设计的shRNA具有明显的沉默效果,并对小鼠肺部炎症有一定的治疗作用,为IL-33的理论基础和临床应用的进一步研究奠定了基础。